Caracterização funcional e estrutural de uma fosfolipase tipo A2 isolada da secreção cutânea do anuro Pithecopus azureus (Phyllomedusa azurea)

Abstract

A secreção cutânea de anfíbios é extremamente rica em moléculas bioativas, as quais protegem o animal desde diversos microrganismos à predadores. Em se tratando de riqueza, a família Phyllomedusa ganhou grande destaque, pois o tecido cutâneo das espécies que o compõem apresentaram grande diversidade de biomoléculas. Além dos peptídeos, uma enorme gama de substâncias químicas também são encontradas na secreção cutânea de anfíbios, tais como aminas, terpenos, esteroides, alcaloides e enzimas. Recentemente PLA2s estão sendo descritas em secreções de anfíbios, embora quase não haja sequência primária de aminoácidos destes animais publicada. As fosfolipases são enzimas esterolíticas as quais hidrolisam glicerofosfolipídeos, sendo as do tipo A2 (PLA2s) comumente presentes em peçonhas de serpentes. Estas enzimas regulam uma variedade de funções fisiológicas e fisiopatológicas e, quando alteradas no organismo, contribuem para diversas doenças humanas, sendo, portanto, alvos terapêuticos para a prevenção e tratamento de doenças. Assim, o objetivo desse estudo foi a caracterização funcional e estrutural de uma fosfolipase do tipo A2 presente na secreção cutânea do anfíbio brasileiro Pithecopus azureus. A secreção cutânea foi obtida por eletroestimulação, liofilizada e fracionada por meio de cromatografia líquida (RP-HPLC) obtendo-se aproximadamente 45 frações, as quais foram submetidas a um ensaio prévio de atividade enzimática para identificação da fração de interesse. A fração de interesse teve a massa de seus compostos analisados em MALDI-TOF/TOF. Purificada, a fosfolipase foi submetida ao ensaio de caracterização enzimática. A caracterização química parcial da fosfolipase foi obtida por espectrometria de massas, incluindo análises em MALDI TOF/TOF e LC MS/MS e pelo sequenciamento de novo obtido pelo PEAKS 7. Assim, a massa molecular média da enzima (de 15383 Da) foi obtida, bem como o sequenciamento de novo, com possíveis glicosilações. Análises da estrutura secundária e da estabilidade térmica foram feitas por dicroísmo circular, resultando em maior percentual em α-Hélice seguida de folha-β. A caracterização enzimática com determinação de Km e Vmax foi realizada, sendo comparada com outras fosfolipases que utilizaram o mesmo substrato. Por fim, para avaliar atividade biológica, a fosfolipase foi testada contra bactérias Gram-positivas e Gam-negativas, apresentando atividade. As análises estatísticas dos dados foram feitas por ANOVA.