Degradação de gossipol por macrofungos e análise do secretoma de Panus lecomtei durante crescimento em caroço de algodão

Abstract

A torta de caroço de algodão (TCA) é um abundante subproduto obtido de agroindústrias, rico em proteínas. Entretanto, sua aplicação na nutrição de animais monogástricos é limitada pela presença de gossipol livre (GL), uma substância tóxica. Alguns fungos basidiomicetos são capazes de degradar TCA quando cultivados em fermentação em estado sólido (FES), secretando enzimas hidrolíticas e lignolíticas. Neste estudo, o potencial de macrofungos na degradação de GL foi avaliado e proteínas potencialmente envolvidas na biodestoxificação desse fator antinutricional foram identificadas. Para detectar de forma precisa o GL em baixos níveis, foi desenvolvido um método em cromatografia líquida de ultra eficiência (UHPLC) para quantificar GL em diferentes amostras. Os limites de detecção e quantificação foram observados em 0,2 e 0,5 μg/mL, respectivamente, com boa reprodutibilidade, precisão (RSD-Relative Standard Deviation) <10% e recuperação superior a 94%. Empregando-se esse método foi possível selecionar diferentes macrofungos capazes de degradar GL quando cultivados em FES. Os macrofungos promissores foram Pleurotus ostreatus (CC389), Pleurotus sapidus (CC28), Panus lecomtei (CC40), Ganoderma lucidum (CC351) e Pycnoporus sanguineus (CC400). Em outro momento, foram comparados diferentes métodos de pré-tratamento para redução de GL em caroço de algodão. Um tratamento químico com Ca(OH)2 eliminou 99,9% do GL; a pré- compostagem biológica reduziu o GL em 99% após seis dias, e um método físico (autoclavagem) em 96,3% após exposição de 60 minutos. Um pré-tratamento utilizando um método combinado de autoclavagem seguida de FES por macrofungos, forneceu maiores níveis de reduções do que os mencionados acima, como também ofereceram melhorias nutricionais nas características do substrato final obtido, elevando os teores de proteína total e reduzindo lipídios totais. O substrato colonizado com os macrofungos P. ostreatus e P. lecomtei foi analisado quanto à presença de enzimas lacases e manganês peroxidase secretadas por fungos em um período de incubação de 15 dias. Na segunda etapa, P. lecomtei foi selecionado e novamente inoculado nas biomassas: caroço de algodão (CAT) tratado por autoclavagem e caroço de algodão tratado com Ca (OH)2 (CAT-TR). Extratos brutos (EBs) foram obtidos a partir de cada cultivo e foram testados quanto à capacidade em degradar gossipol sintético (gossipol acetato) e inibidores enzimáticos derivados da lignina. Foi observada degradação total do gossipol sintético em apenas 60 minutos de incubação com degradação de inibidores enzimáticos, com destaque para o EB derivado de CAT-TR, com degradação de até 95% de ácido sinápico ao final de 240 minutos de incubação. Foram utilizadas abordagens proteômicas com o intuito de caracterizar o perfil do secretoma desses EBs (obtidos após seis e 12 dias de cultivo), por LC-MS/MS. Diferentes perfis protéicos foram identificados de acordo com o tipo de pré-tratamento empregado na biomassa bem como em função dos tempos de cultivo. Sendo assim, é provável que diferentes proteínas estejam envolvidas na sobrevivência do fungo e também na degradação de compostos tóxicos como o gossipol. As proteínas/enzimas com potencial biotecnológico obtidas dos EBs incluíram as lacases, peroxidases, oxidoredutases, heat shock proteins, metaloproteases, glucanases e citocromo b5, que atuam em vias envolvidas na oxidação de substratos, destoxificação de fatores tóxicos, estresse oxidativo, como quelantes de metais, degradação de lignina e respiração celular. A produção dessas enzimas pode ter ocorrido devido à presença do gossipol, com participação destas na biodestoxificação de GL, potencializando o uso de CAT na nutrição de animiais monogástricos. Em resumo, os resultados deste estudo demonstraram eficiente degradação de GL por ação de diferentes abordagens econômicas e não poluentes. Os mecanismos enzimáticos envolvidos na degradação de GL foram investigados, com P. lecomtei apresentando considerável capacidade de produzir enzimas para a degradação de GL assim como da parede celular vegetal, com significativo potencial biotecnológico.