Efeito da fonte protéica durante o cultivo na qualidade e quantidade de embriões bovinos produzidos in vitro

Abstract

O sucesso da PIV está relacionado ao conhecimento das necessidades dos gametas e embriões em diferentes fases do desenvolvimento. É conhecido que embriões PIV são diferentes dos embriões in vivo em vários aspectos. As diferenças entre os dois modelos têm sido pesquisadas na tentativa de tornar os meios artificiais o mais próximo possível ao ambiente natural do embrião. Para tanto, a viabilidade desses embriões (in vivo ou in vitro, oriundos de distintos sistemas de produção) pode ser mensurada por ferramentas diversas, tais como a criotolerância, a análise do metabolismo, os níveis e a expressão de genes. A suplementação protéica dos meios de cultivo tem sido amplamente discutida, na busca pela utilização de meios definidos, onde há o conhecimento da sua composição, possibilitando a eliminação ou acréscimo de produtos benéficos ao embrião, sem que ocorra influência de fatores inerentes desconhecidos do meio – características normalmente atribuídas aos componentes séricos, os quais são mais comumente utilizados, em especial o Soro Fetal Bovino (SFB) e a Albumina Sérica Bovina (BSA). Neste estudo, os efeitos do SFB e da BSA-faf durante a PIV de embriões bovinos, foram investigados quanto à quantidade na produção de blastocistos e em termos de qualidade, quando submetidos à vitrificação e análise de expressão gênica. Foram maturados, fecundados e cultivados in vitro 2.171 ovócitos, oriundos de abatedouro. Em cada réplica, os CCOs foram distribuídos em três tratamentos (T1: suplementação com SFB; T2: suplementação com BSA; T3: suplementação inicial com BSA e final com SFB.). Quanto à taxa de clivagem (D2), não houve diferença entre os tratamentos; porém quanto às taxas de blastocisto, T1 foi superior aos T2 e T3 nos dias 6,5 a 8,5 de avaliação (P<0.001). Os embriões de todos os tratamentos que alcançaram estágio de BL e/ou BX (total de 507 embriões) nos dias 6,5 e 7,5 foram separados e, 50% deles, vitrificados pelo método da OPS, descongelados, retornando então ao CIV, e observados às 24, 48 e 72 horas pós-vitrificação; os outros 50% dos embriões permaneceram como grupo controle. Para esta análise, foram consideradas re-expansão e eclosão das estruturas analisadas como parâmetro de avaliação, mediante os fatores tratamento (T1 vs. T2 e T3), grupo (C vs. V), estágio embrionário (BL vs. BX) e tempo (D6,5 vs. D7,5). Em suma, os resultados para o teste de criotolerância foram: T1=T2>T3; C>V; BX>BL; D6,5>D7,5. Quatro pools com 9 blastocistos eclodidos do grupo controle em D8,5, de cada tratamento, foram formados para avaliação da expressão dos genes MnSOD, Bax, BCL-2, HSP-70, CIRP-b, ACAT-2 e ATP8A1. Para normalização dos dados, foram utilizados os genes constitutivos Actina e GAPDH. A expressão da maioria dos genes não foi significativamente diferente entre T1 e T2, exceto para o ACAT-2 – o qual se diferenciou devido à composição protéica do meio. A menor expressão significativa no T3, pode indicar uma condição sub-ótima deste meio à PIV de embriões. A suplementação com SFB produziu mais embriões e com qualidade semelhante a aqueles produzidos em suplementação de BSA-faf. É possível, portanto, concluir que os componentes séricos presentes no soro não afetaram os parâmetros analisados neste estudo. Possíveis efeitos no desenvolvimento embrionário avançado e fetal, bem como a variação entre as partidas de soro, devem ser analisados em outros experimentos. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The embryo IVP success is related to the knowledge of main requirements from gametes and embryos in different stages of development. It is well known that IVP embryos are quite different of those counterparts in vivo in many aspects. Dissimilarity between both has been studied in tempting to turn artificially mediums mostly similar to embryo natural environment. For that, viability of these embryos (in vivo or in vitro, from diverses systems of production) may be measured by a variety of tools, such as cryotolerance, metabolism analysis, genes levels and expression. Protein medium supplementation in cultive has been largely discussed as well, aiming the substitution for defined components, where there is comprehension of its composition, eliminating or adding benefic products to the embryo in this way, without existing unknown factors in it – characteristics usually attributed to serum components, whose most used are Bovine Calf Serum (FCS) and Bovine Serum Albumin (BSA). In this study, the effects of FCS being substituted total or partially by BSA-faf during bovine embryos IVP, were investigated to quantity (blastocysts rate) and quality, when submitted to vitrification and gene expression analysis. Two thousand one hundred seventy one (2.171) oocytes obtained from abattoir ovary were matured, fertilized and cultured in vitro. In each replicate, CCOs were distributed in three treatments: (T1: supplementation with FCS on IVM and IVC; T2: supplementation with BSA on IVM and IVC; T3: supplementation with BSA on IVM and at the beginning of IVC and FCS, at the end of IVC). For cleavage rates (D2), there were no difference among treatments; therefore for blastocysts rates, T1 was superior to T2 and T3 on days 6.5 to 8.5 of development evaluation (P<0.001). Embryos from all treatments which have reached BL and/or BX stage (507 embryos, in total) were separated and, 50% of them, vitrified by OPS method, post-thawed, returning then to IVC, and observed at 24, 48 and 72 hours post-vitrification; other 50% remaining embryos were preserved as control group. For these analysis, were considered structures re-expansion and hatching rates as a parameter to evaluate factors as treatment (T1 vs. T2 and T3), groups (C vs. V), embryo development stage (BL vs. BX) and time (D6.5 vs. D7.5). At a glance, results for cryotolerance test related to these parameters were: T1=T2>T3; C>V; BX>BL; D6.5>D7.5. Four pools with 9 hatched blastocysts from Control group on D8.5, from each treatment, were formed to evaluate the expression of genes MnSOD, Bax, BCL-2, HSP-70, CIRP-b, ACAT-2 and ATP8A1. To standardize data, the constitutive genes, Actina and GAPDH, were taken. The majority genes expressions were not significantly different between T1 and T2, except for ACAT-2 – who might be due to the medium protein source composition. The smaller and significant expression on T3, should indicate a suboptimal condition of this medium to embryo IVP. The supplementation with FCS produced more embryos with similar quality to those originated from BSA-faf supplementation. It is possible therefore, to conclude that serum components do not affected the parameters analyzed here, in this working environment. Possible effects in late embryo and fetal development, as well as variation among serum batches, should be verified in other experiments.