Genes diferencialmente expressos em Paracoccidioides brasiliensis

Abstract

Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico causador da paracoccidioidomicose, uma doença endêmica na America Latina. A transição da forma miceliana (22°C) para forma levedura (36 °C) é induzida pela mudança da temperatura do ambiente para aquela no hospedeiro mamífero. Genes que são diferencialmente expressos nas fases de P. brasiliensis podem ser relevantes para o dimorfismo, e para o estabelecimento da infecção. No presente trabalho descrevemos a análise de genes diferencialmente expressos de P. brasiliensis. O gene da formamidase foi descrito como altamente expresso na fase miceliana de P. brasiliensis, isolado Pb01. Formamida aminohidrolase (formamidase, EC 3.5.1.49) catalisa a hidrólise específica da formamida para produção de amônia e formato. Nós identificamos a formamidase de P. brasiliensis, a qual reage com anticorpos presentes em soro de pacientes infectados com P. brasiliensis. O cDNA do gene foi clonado e a proteína heteróloga foi produzida e purificada. Adicionalmente, a proteína recombinante purificada foi reconhecida por soro de pacientes diagnosticados com paracoccidioidomicose e não reagiu com soro de indivíduos saudáveis. A proteína recombinante de 45-kDa foi cataliticamente ativa e sua atividade foi detectada em extratos protéicos das fases miceliana e leveduriforme de P. brasiliensis. A formamidase recombinante foi utilizada na produção de anticorpo policlonal em camundongos, que mostrou uma alta especificidade em ensaios de Western blot. A purificação da proteína nativa foi realizada em dois passos de cromatografia. As frações com atividade de formamidase foram selecionadas e analisadas por SDS-PAGE, o qual revelou uma proteína com massa molecular de 180-kDa. A proteína nativa purificada foi submetida à espectrometria de massas e foi identificada como formamidase. Adicionalmente, ensaios de SDS-PAGE com extratos protéicos desnaturados por calor revelaram uma proteína com massa molecular de 45-kDa. Estes resultados sugerem que a formamidase de P. brasiliensis é uma proteína tetramérica. A localização celular da proteína nativa em células fúngicas leveduriformes foi realizada através de microscopia confocal e de transmissão. A formamidase de P. brasiliensis foi encontrada no citoplasma e parede celular. Com o objetivo de elucidar o papel desta molécula, o cDNA codificante para formamidase foi utilizado para rastrear uma biblioteca construída com cDNAs de leveduras de P. brasiliensis utilizando o sistema de duplo-híbridos em Saccharomyces cerevisiae. Proteínas relacionadas com enovelamento protéico, processamento e destinação foram encontradas, as quais podem estar relacionadas com a localização da formamidase na parede celular, bem como com seu envolvimento no metabolismo de nitrogênio de P. brasiliensis. Um modelo das interações da formamidase foi construído. Nós avaliamos genes possivelmente envolvidos no estabelecimento da fase leveduriforme de P. brasiliensis. Mudanças na expressão gênica na fase levedura foram analisadas por meio da comparação do isolado Pb01 com um isolado que mantém a forma miceliana a 37 °C, utilizando a estratégia metodológica subtrativa cDNA-RDA. Em esforço para ajudar a identificação dos produtos gênicos associados com a fase leveduriforme parasita, perfis de cDNAs foram gerados de células leveduras do isolado Pb01 e do isolado Pb4940, o último cresce in vitro como micélio na temperatura do hospedeiro. O isolado Pb01 induziu a expressão de uma variedade de transcritos codificantes para proteínas relacionadas com resposta ao estresse, composição da parede/membrana celular, quando comparado com o isolado Pb4940, provavelmente refletindo o estabelecimento e manutenção da fase leveduriforme parasitária de P. brasiliensis. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Paracoccidioides brasiliensis is a thermally dimorphic fungus causing paracoccidioidomycosis, an endemic disease widespread in Latin America. The dimorphic transition from the mycelia (22 ºC) to the yeast (36 ºC) form is induced by a shift from the environmental temperature to that of the mammalian host. Genes that are differentially expressed in phases of P. brasiliensis can be relevant to the dimorphism, and to the establishment of infection. Here we describe the analysis of differentially expressed genes of P. brasiliensis. The formamidase gene of P. brasiliensis was described as highly expressed in mycelia of P. brasiliensis, isolate Pb01. Formamide aminohydrolase (formamidase, EC 3.5.1.49) catalyzes the specific hydrolysis of formamide to produce ammonia and formate. We identified the formamidase of P. brasiliensis, which reacts with antibodies present in sera of P. brasiliensis infected patients. The cDNA of the gene was cloned and the heterologous protein was produced and purified. Also, the purified recombinant protein was recognized by sera of patients with proven paracoccidioidomycosis and not by sera of healthy individuals. The recombinant 45-kDa protein was shown to be catalytically active and formamidase activity was also detected in P. brasiliensis yeast and mycelium protein extracts. The recombinant formamidase was used to produce polyclonal antibody in mice, which showed high specificity in western blot assay. We also performed purification of the native protein in two steps of chromatography. Fractions with formamidase activity were selected and analysed by SDS-PAGE, which revealed a protein with molecular mass of 180-kDa. The purified native protein was submitted to mass spectrometry and was identified as formamidase. Additionally, SDS-PAGE assay with heat-denatured protein extracts revealed a protein with molecular mass of 45-kDa. Those results suggest that P. brasiliensis formamidase is a tetrameric protein. The cellular localization of the native protein in fungal yeast cells was performed by confocal and transmission electron microscopy. The P. brasiliensis formamidase was found in cytoplasm and cell wall. In order to elucidate the role of this molecule, the cDNA encoding formamidase was used to screen a library constructed with P. brasiliensis yeast cells cDNAs using a Saccharomyces cerevisiae two-hybrid system. Proteins related with protein folding, processing and destination were found, which can be related to the cell wall localization of formamidase, as well as with the protein involvement in nitrogen metabolism of P. brasiliensis. A model for formamidase interactions is provided. We evaluated genes putatively involved in the establishment of yeast phase of P. brasiliensis. Changes in gene expression in the yeast phase were analyzed by comparison of the isolate Pb01 to a non-differentiating mycelia-like isolate using subtractive the cDNA-RDA methodological strategy. In an effort to help identify gene products associated with the yeast parasitic phase, cDNAs profiles were generated from yeast cells of isolate Pb01 and from isolate Pb4940, the last growing as mycelia at the host temperature. The isolate Pb01 induced the expression of a variety of transcripts encoding some proteins related to stress response, cell wall/membrane composition, compared to isolate Pb4940, probably reflecting the establishment/maintenance of the P. brasiliensis yeast parasitic phase.