Produção de Virus Like Particles do vírus da febre amarela e do vírus Mayaro em células de inseto

Abstract

Baculovírus são um grupo de vírus extensamente estudados utilizados como controle biológico de pragas agrícolas, e como ferramenta biotecnológica para expressão de proteínas heterólogas. O vírus infecta naturalmente e exclusivamente insetos, sendo a sua manipulação laboratorial extremamente segura. Sua utilização como vetor para expressão em células de inseto apresenta diversas vantagens, como a capacidade do genoma viral de comportar a inserção de grandes segmentos de DNA de interesse, assim como a ocorrência de modificações pós-traducionais mais complexas ocorridas nas células eucarióticas. Essa tecnologia possuí ampla utilização na indústria para produção proteínas antigênicas de diversos patógenos, com aplicações vacinais e de diagnóstico. Uma estratégia atualmente muito promissora para desenvolvimento de vacinas é a produção e utilização de VLPs (“Virus like particles”). VLPs são partículas que utilizam da capacidade de automontagem de proteínas estruturais de vírus para formação de estruturas que se assemelham a estrutura de partículas virais, porém não possuem material genético e, consequentemente, não são capazes de ocasionar infecção. O sistema de expressão usando baculovírus em células de inseto já foi utilizado para produção de VLPs de diversos vírus, o que resultou no desenvolvimento de vacinas comerciais contra o papiloma vírus humano. Neste trabalho, foram construídos baculovírus recombinantes como ferramentas para expressão de proteínas, e produção de VLPs de dois vírus transmitidos por artrópodes (arbovírus): vírus da febre amarela (“Yellow fever vírus” – YFV), membro do gênero flavivirus, e do vírus Mayaro (MAYV), membro do gênero alphavirus. No capítulo 1 é descrita a construção de baculovírus utilizando de estratégias de controle temporal da expressão gênica, para coexpressão de proteínas não-estruturais (proteínas NS2A, NS2B e NS3), e proteínas estruturais (C, prM e E) do YFV. Isso foi feito com o objetivo de induzir a maturação das proteínas estruturais virais, e formação de estruturas complexas. A infecção dos baculovírus recombinante em células Tn5B levou a indução de fusão de membranas celulares bastante evidente, efeito citopático claro conhecido da atividade da proteína de envelope viral E de flavivirus. Essa indução de fusão de membranas foi exacerbada pela coexpressão de ambas as proteínas não-estruturais e estruturais, se comparada a expressão individual das proteínas estruturais, indicando importante papel de complementação para produção de proteínas maduras com alta atividade fusogênica. Análises de microscopia eletrônica de transmissão (MET) revelaram a formação de partículas que se assemelham a vírions do YFV em estruturas membranosas citoplasmáticas, e da presença de partículas no meio de cultura de células infectadas. O capítulo 2 descreve a construção de baculovírus recombinantes contendo genes estruturais do MAYV (C, E3, E2, 6k e E1). Foi confirmada a expressão das proteínas em células de inseto por Western blot, mostrando o processamento da poliproteína e liberação da proteína de envelope E1 clivada, assim como da proteína de capsídeo C. A localização celular destas proteínas virais foi analisada por imunomarcação e microscopia de fluorescência, indicando a concentração da proteína E1 na membrana celular, e da proteína C no núcleo. Análise do meio de cultura de cultura de células infectadas por contrastação negativa em MET, após ultracentrifugação, indicou a presença de partículas com as dimensões esperadas de vírions de alphavirus. Este trabalho reforça a flexibilidade do sistema de expressão de baculovírus em células de inseto para produção de antígenos de arbovírus emergentes que podem ter grande impacto na saúde pública.