Metagenomic analysis of the begomovirus diversity in tomatoes in Central Brazil and impact of the Ty-1 tolerance gene on viral evolutionary dynamics

Abstract

O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é uma das principais hortaliças cultivadas no Brasil. Até o início década de 1990, a ocorrência de doenças causadas por espécies de Begomovirus (família Geminiviridae) era esporádica no país. Entretanto, a partir deste período, um complexo extremamente diverso de espécies de begomovírus emergiu no cultivo do tomateiro, coincidindo com a ampla dispersão geográfica do vetor Bemisia tabaci MEAM 1 (Middle East-Asian Minor 1= biótipo B). A maioria dos begomovírus apresenta genoma bipartido e apresentam níveis variados de eficiência de transmissão pelo vetor. A utilização mais intensa de híbridos resistentes/tolerantes (principalmente com o gene Ty–1) é um potentical fator no processo de evolução deste grupo de vírus no Brasil. A metagenômica aliada ao Next-Generation Sequencing – NGS é uma das ferramentas mais eficientes para analisar, em larga escala, a diversidade de populações virais em diferentes condições ambientais. Neste contexto, o objetivo geral do presente trabalho foi conduzir estudos de metagenômica sobre a diversidade de begomovírus em tomateiro no Brasil. Os objetivos específicos foram: (a) conduzir estudos comparativos da diversidade de begomovírus infectando tomateiros com e sem o gene Ty–1 e (b) catalogar as espécies virais predominantes e/ou novas espécies de Begomovirus ocorrendo em tomateiros com e sem o gene Ty–1. Para isto, 107 amostras foram coletadas em campos de produção em Goiás (n=56), Distrito Federal (n=27) e Minas Gerais (n=24) entre os anos de 2002 e 2016. O DNA total das amostras foi extraído e submetido a PCR usando primers para detecção de begomovírus e também com primers para região genômica ligada ao gene Ty–1. Posteriormente as amostras foram submetidas a um enriquecimento via RCA (Rolling Circle Amplification) e divididas em dois pools: tomateiros sem o gene Ty–1 (n=64) e com o gene Ty–1 (n=43). Os dois pools foram sequenciados em uma plataforma Illumina HiSeq2500. As sequências obtidas foram montadas no programa CLC Genomics Workbench 11.0 e analisadas no Geneious 10.1. As sequências então foram comparadas com sequências virais presentes no GenBank utilizando o algoritmo BLASTn. Pares de primers específicos foram desenhados visando recuperar o genoma completo e confirmar a presença dos vírus em amostras individuais dentro de cada pool. Os resultados destas análises estão descritos no capítulo 2. Foi observada uma maior diversidade de espécies virais (n=14) no pool de amostras sem o gene Ty–1 em comparação com aquelas obtidas de plantas com gene Ty–1 (n=6). Observou-se uma aparente filtragem entre as espécies detectadas nos dois pools. Foi também observada uma grande frequência de infecções mistas nas amostras, tendo casos da ocorrência simultânea de até cinco espécies em uma única amostra. Três potenciais novas espécies foram detectadas, duas em amostras sem o gene Ty– 1 (MG-378 e GO-169) e uma em amostras contendo o gene Ty–1 (DF-640). Além disso, uma espécie do gênero Gemycircularvirus e um novo Alfasatélite foram detectados. Tomato golden vein virus (TGVV) foi uma das espécies amplamente detectadas nessas análises. Estudos conduzidos no capítulo 3, mostraram que TGVV e Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV) estão intimamente relacionados como indicado por análises empregando Sequence Demarcation Tool (SDT) e alinhamento MUSCLE. Dois grupos bem definidos foram identificados, consistentes

com os critérios atuais para demarcação de espécies de Begomovirus, sendo também identificado um conjunto distinto características genômicas, biológicas e ecológicas específicas para cada espécie viral. Uma reavaliação dos isolados de TGVV e ToYVSV disponíveis no GenBank mostrou que uma grande fração está erroneamente classificada ao nível de espécie. A espécie Bean golden mosaic virus (BGMV) foi detectada em associação com tomateiro nas análises conduzidas no capítulo 1. No capítulo 4 a diversidade de 161 isolados classificados como BGMV foi catalogada comparando suas sequências completas com o DNA–A e DNA–B do isolado de referência. Análises filogenéticas e com SDT indicaram que os isolados descritos coletivamente como BGMV compreendem, de fato, duas espécies distintas: uma que engloba isolados de BGMV de Phaseolus vulgaris e de uma ampla gama de hospedeiros (incluindo o tomateiro) e uma espécie estreitamente relacionada (com identidade variando de 89 a 91% em comparação com o isolado de referência de BGMV) principalmente associada ao feijão-lima (P. lunatus). O capítulo 5 descreve as características moleculares de um Gemycircularvirus (2.189 nucleotídeos) identificado em associação com o tomateiro no Brasil Central. As análises mostraram que a espécie identificada compartilhou 99% de identidade com um vírus provisoriamente denominado como Plant-associated genomovirus 12 de Larrea tridentata. O capítulo 6 descreve duas novas espécies de Begomovirus que foram identificadas em amostras de Minas Gerais e Goiás. Os genomas virais completos foram clonados, sequenciados via Sanger e provisoriamente denominados Tomato golden net virus – ToGNV (2.649 nucleotídeos) e Tomato yellow net virus – ToYNV (2.636 nucleotídeos). Ambos os vírus exibiram a organização do DNA–A com características típicas das espécies de begomovírus do Novo Mundo. No entanto, nenhum componente cognato do DNA–B foi encontrado, indicando que ToGNV e ToYNV provavelmente compreendem um grupo peculiar de begomovírus neotropicais monopartidos.