Produção, caracterização e avaliação citotóxica de membranas lipídicas miméticas para a liberação do tripanocida N, N’-Squaramide 17 na linhagem CL-Brener de Trypanosoma cruzi

Abstract

A doença de Chagas afeta cerca de 25 milhões de pessoas no mundo e é causada por Trypanosoma cruzi (T.c.). Atualmente, os dois únicos medicamentos disponíveis utilizados para o tratamento desta enfermidade - benzonidazol (BZ) e nifurtimox - provocam efeitos adversos no paciente. Com isso, novos fármacos têm sido estudados a fim de se encontrar estratégias terapêuticas mais eficientes, como o N, N'-Squaramide 17 (S) um composto com excelente potencial terapêutico. Por meio da nanotecnologia, é possível aumentar a eficiência de fármacos e reduzir a sua toxicidade, graças às propriedades de nanoestruturas que podem favorecer a liberação sustentada, utilizando doses baixas do fármaco e aumentando sua concentração nos tecidos alvos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver membranas lipídicas miméticas, a partir de lipídios das membranas celulares de macrófagos (linhagem RAW 264.7) e encapsular o S nesta nanoestrutura, visando melhorar sua eficácia tripanocida sobre linhagem CL-Brener. Assim, foram desenvolvidas e caracterizadas as nanoestruturas: (1) membrana mimética lipídica contendo S (MLS); (2) membrana mimética lipídica vazia (MLV) e (3) N, N’-Squaramide 17 extrusado (SE). Adicionalmente, foram avaliados as características físico-químicas e os efeitos citotóxico e tripanocida destas nanoestruturas. O diâmetro hidrodinâmico (dH) médio e potencial zeta das nanoestruturas foram, respectivamente, de 196.5 ± 11 nm/– 61.43 ± 2.3 mV para MLS;

203.1 ± 8.5 nm/– 12.9 ± 1,2 mV para MLV e 713.9 ± 112.6 nm/– 45.3 ± 7.45 mV para SE. Notou- se que o dH da MLS reduziu em torno de 70 nm após 10 dias de armazenamento, indicando

possível liberação do S. A encapsulação de S nas membranas miméticas foi comprovada empregando a análise de espectroscopia vibracional na região do infravermelho (IR) e notou-se que a nanoestrutura MLS apresentou bandas em 1788 cm-1 e 1674 cm-1 características dos grupos carbonilas existentes em S. Em relação aos efeitos citotóxicos, após 72h de tratamento, observou-se que a MLV apresentou excelente potencial como veículo para entrega de fármacos visto ter nenhuma citotoxicidade em células de mamíferos nas concentrações testados. Por outro lado, MLS, nanoestrutura contendo o S, foi ativo contra epimastigotas (IC50 de 15,9 ± 4,8 μM) e amastigotas intracelulares (IC50 de 24,99 ±4,8 μM). Ademais, induziu baixa citotoxicidade com IC50 de 626.7 ± 4.7 em células VERO e de 1974 ± 6 em RAW 264.7. A partir destes dados, determinou-se o índice de seletividade (SI) e observou-se que MLS induziu atividade tripanocida superior ao BZ em 57 vezes quando foram avaliadas a forma epimastigota e 9 vezes maior em amastigota, mostrando ter ação alvo específica. Nos ensaios de infecção celular, as células VERO foram infectadas com tripomastigotas e posteriormente incubadas com a metade da citotoxicidade (IC50/2): (313 μM) de MLS por 12 h e depois analisou-se sua atividade tripanocida durante oito dias. Observou-se no 8o dia maior inibição na taxa de infecção de amastigotas (72 %) do que com o tratamento com BZ (51%) (6.84 μM). Ainda, o número de tripomastigotas extracelulares foi reduzido em 81 % após tratamento com MLS enquanto que BZ reduziu em 54 %. MLS também induziu alterações estruturais nos parasitas como fissuras com diâmetro de aproximadamente 200 nm na parte superior celular da epimastigota e em tripomastigota uma diferenciação em amastigota. Desta forma, MLS apresentou promissora eficácia tripanocida. Ademais, o fato da MLS ter induzido baixa citotoxicidade nas linhagens celular de mamíferos (RAW 264.7 e VERO) e elevada atividade contra os parasitas demonstra sua toxicidade alvo- específica, tornando, assim, estas nanoestruturas promissoras para aplicação no tratamento da doença de Chagas.