Respostas moleculares e fisiológicas de Pichia pastoris a componentes de hidrolisado lignocelulósico

Abstract

Komagataella phaffii, anteriormente conhecida como Pichia pastoris, é um organismo modelo comummente usado na pesquisa e na indústria. Tem sido considerada para a produção de produtos de alto valor agregado, especialmente proteínas. Suas aplicações biotecnológicas envolvem principalmente a utilização de fontes clássicas de carbono como glicose, glicerol, sorbitol e metanol, embora muitos outros substratos também tenham sido pesquisados. As biomassas lignocelulósicas são ricas em açúcares fermentáveis, como a xilose, o segundo açúcar mais abundante na natureza, que pode ser usado para a produção de produtos químicos renováveis. No entanto, a utilização microbiana da xilose depende da capacidade inata de utilização desta pelo microrganismo, e de sua tolerância aos compostos inibidores presentes nos hidrolisados lignocelulósicos. Atualmente, entende-se que P. pastoris não é capaz de utilizar xilose como fonte de carbono a menos que seja modificada para isso, e sua sensibilidade a tais inibidores é pouco compreendida. Neste estudo, apresentamos as respostas moleculares e fisiológicas de P. pastoris aos principais componentes do hidrolisado lignocelulósico: inibidores derivados da lignocelulose, e a xilose. A análise fisiológica e transcricional de P. pastoris X33 para ácido acético, furaldeídos e hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar mostrou que eles afetam o metabolismo celular de forma dose-dependente, e se correlacionam positivamente com a quantidade de genes diferencialmente expressos. Ao contrário de outras leveduras industriais como Saccharomyces cerevisiae, P. pastoris pode consumir concomitantemente ácido acético com glicose como fonte de carbono, possivelmente ajudando a reduzir sua toxicidade para as células. A tolerância ao inibidor, e a capacidade de utilização da xilose de 25 isolados diferentes naturais e um de laboratório de Komagataella, de seis espécies diferentes, também foram avaliadas. Nenhum isolado com tolerância aos inibidores distintamente maior foi identificado, entretanto linhagens capazes de crescer em xilose foram. Três linhagens de melhor crescimento foram selecionadas e submetidas à engenharia adaptativa de laboratório (ALE) para otimização do consumo de xilose. A caracterização detalhada da assimilação da xilose pela via de oxirredução foi confirmada por ensaios utilizando marcação com isótopos de carbono 13C, apesar de precisar de mais de dez dias para duplicar. Por fim, uma estratégia de engenharia genética foi empregada para melhorar a tolerância de P. pastoris X33 ao ácido acético. Para isso, o gene homólogo HAA1, previamente descrito em S. cerevisiae como fator de transcrição envolvido na resposta ao estresse com ácido acético, foi identificado e superexpresso em P. pastoris X33. Isso melhorou o crescimento da levedura na presença de 2g.L-1 4,9 vezes após 24 h de cultivo. Juntos, os resultados apresentados aqui abrem caminho para a compreensão do metabolismo de P. pastoris na presença de hidrolisados lignocelulósicos, ácido acético, furaldeídos e xilose.