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Título: Produção de antissoros policlonais a partir de expressão transiente do gene do nucleocapsídeo de watermelon crinkle leaf-associated virus 1 e 2
Autor(es): Kauffmann, Caterynne Melo
Orientador(es): Nagata, Tatsuya
Assunto: Cucurbitáceas
Coguvirus
Antissoros policlonais
Data de publicação: 7-Dez-2021
Referência: KAUFFMANN, Caterynne Melo.Produção de antissoros policlonais a partir de expressão transiente do gene do nucleocapsídeo de watermelon crinkle leaf-associated virus 1 e 2. 2021. 49 f., il. Dissertação (Mestrado em Fitopatologia)—Universidade de Brasília, Brasília, 2021.
Resumo: A melancia [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai] é um fruto de importância econômica em todo o mundo, sendo muito cultivado dentro das cucurbitáceas (Santos et al., 2011). Recentemente, o watermelon crinkle leaf-associated virus 1 e 2 (WCLaV-1 e -2) foram relatados na China (Xin et al., 2017) e nos Estados Unidos (Hernandez et al., 2021), ocasionando sintomas de mosaico amarelo e deformação foliar em campos de produção. No Nordeste brasileiro, nos Estados do Ceará, Bahia e Piauí foi relatada a presença do WCLaV-1 e/ou -2, causando os mesmos tipos de sintomas (Maeda et al., 2021). Assim, o objetivo desse trabalho foi a produção de antissoros policlonais de WCLaV-1 e -2 presentes no Brasil, a partir de expressão transiente de proteína em plantas, para fins de detecção. Os fragmentos de cDNA do nucleocapsídeo (NC) de ambos os isolados virais foram clonados na construção de cDNA de RNA-2 do vetor viral pepper ringspot virus (PepRSV) (Tavares-Esashika et al., 2020) utilizando reações de Gibson Assembly. Os clones foram transfectados em Escherichia coli cepa DH10B por eletroporação (Blawid & Nagata, 2015). Após a confirmação das sequências por método Sanger, Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101:pMP90 foi transformada com as construções. Plantas de Nicotiana benthamiana foram agroinfiltradas com as construções do RNA-2 modificadas junto com RNA-1, e quatro dias depois, as proteínas recombinantes do NC das duas espécies virais foram analisadas por Western blotting, utilizando anticorpo para HisTag, pois as proteínas recombinantes possuem cauda de hexahistidina nos terminais- C. Realizou-se purificação da proteína do NC do WCLaV-1 e -2 de acordo com protocolo estabelecido pelo laboratório de Virologia Geral da UnB utilizando a resina de Ni-NTA. Os antígenos purificados foram injetados em coelho, separadamente, por injeção com intervalo de 3 semanas, total de 3 injeções. A primeira injeção, o antígeno foi emulsificado com adjuvante Freund’s completo e as outras duas com adjuvante Freund’s incompleto. Os antissoros policlonais produzidos reagiram com proteínas expressadas e vírus semi-purificados, de 10 plantas infectadas de melancieiras com sintomas virais fortes coletados em Juazeiro, Bahia em 2019, por Dot-ELISA. O antissoro do WCLaV-1 reagiu mais especificamente com o WCLaV-1, mas não com o WCLaV-2. Entretanto, apesar do antissoro do WCLaV-2 reagir fortemente com o antígeno alvo, o antissoro apresentou fraca reação com WCLaV-1. Estes anticorpos foram testados utilizando amostras de melancieira estocadas no freezer -70 °C e inoculados mecanicamente, e reagiram em nível médio. As infecções foram confirmadas por RT-PCR e os resultados foram coerentes comparando-os por Dot-ELISA.
Abstract: The watermelon [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai] is a fruit of economic importance throughout the world, being widely cultivated within cucurbits (Santos et al., 2011). Recently, watermelon crinkle leaf- associated virus 1 and 2 (WCLaV-1 and -2) have been reported in China (Xin et al., 2017) and the United States (Hernandez et al., 2021), causing yellow mosaic symptoms and leaf deformation in production fields. In Northeastern Brazil in the states of Ceará, Bahia, and Piauí, the presence of WCLaV-1 and/or -2 has been reported, causing the same type of symptoms (Maeda et al., 2021). Thus, the objective of this work was the production of polyclonal antisera of WCLaV -1 and -2 present in Brazil, from a transient expression of a protein in plants, for detection purposes. Nucleocapsid (NC) cDNA fragments from both viral isolates were cloned into the RNA-2 cDNA construct of the pepper ringspot virus (PepRSV) viral vector (Tavares- Esashika et al., 2020) using Gibson Assembly reactions. Clones were transfected into Escherichia coli strain DH10B by electroporation (Blawid &Nagata, 2015). After sequence confirmation by the Sanger method, Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90 was transformed with the constructs. Nicotiana benthamiana plants were agroinfiltrated with the RNA-2 constructs modified together with RNA-1, and four days later, the recombinant NC proteins of the two viral species were analyzed by Western blotting using the antibody to HisTag, as the recombinant proteins have a hexahistidine-tag at the C-terminal. Purification of NC protein from WCLaV-1 and -2 was carried out according to the protocol established by the General Virology Laboratory of UnB using Ni-NTA resin. The purified antigens were injected into a rabbit, separately, by injection at an interval of 3 weeks, totaling 3 injections. In the first injection, the antigen was emulsified with complete Freund's adjuvant and the other two with incomplete Freund's adjuvant. The polyclonal antisera produced reacted with expressed proteins and semi-purified viruses from 10 infected watermelon plants with strong viral symptoms collected in Juazeiro, Bahia in 2019 by Dot-ELISA. The antiserum from WCLaV-1 reacted more specifically with WCLaV-1 but not WCLaV-2. However, despite the antiserum of WCLaV-2 reacting strongly with the target antigen, the antiserum showed a weak reaction with WCLaV-1. These antibodies were tested using watermelon samples stored in a freezer at -70 °C and mechanically inoculated, and reacted at a medium level. Infections were confirmed by RT-PCR and results were coherently comparing them by Dot-ELISA.
Unidade Acadêmica: Instituto de Ciências Biológicas (IB)
Departamento de Fitopatologia (IB FIT)
Informações adicionais: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2021.
Programa de pós-graduação: Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia
Licença: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Aparece nas coleções:Teses, dissertações e produtos pós-doutorado

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