Produção de antissoros policlonais a partir de expressão transiente do gene do nucleocapsídeo de watermelon crinkle leaf-associated virus 1 e 2

Abstract

A melancia [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai] é um fruto de importância econômica em todo o mundo, sendo muito cultivado dentro das cucurbitáceas (Santos et al., 2011). Recentemente, o watermelon crinkle leaf-associated virus 1 e 2 (WCLaV-1 e -2) foram relatados na China (Xin et al., 2017) e nos Estados Unidos (Hernandez et al., 2021), ocasionando sintomas de mosaico amarelo e deformação foliar em campos de produção. No Nordeste brasileiro, nos Estados do Ceará, Bahia e Piauí foi relatada a presença do WCLaV-1 e/ou -2, causando os mesmos tipos de sintomas (Maeda et al., 2021). Assim, o objetivo desse trabalho foi a produção de antissoros policlonais de WCLaV-1 e -2 presentes no Brasil, a partir de expressão transiente de proteína em plantas, para fins de detecção. Os fragmentos de cDNA do nucleocapsídeo (NC) de ambos os isolados virais foram clonados na construção de cDNA de RNA-2 do vetor viral pepper ringspot virus (PepRSV) (Tavares-Esashika et al., 2020) utilizando reações de Gibson Assembly. Os clones foram transfectados em Escherichia coli cepa DH10B por eletroporação (Blawid & Nagata, 2015). Após a confirmação das sequências por método Sanger, Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101:pMP90 foi transformada com as construções. Plantas de Nicotiana benthamiana foram agroinfiltradas com as construções do RNA-2 modificadas junto com RNA-1, e quatro dias depois, as proteínas recombinantes do NC das duas espécies virais foram analisadas por Western blotting, utilizando

anticorpo para HisTag, pois as proteínas recombinantes possuem cauda de hexahistidina nos terminais- C. Realizou-se purificação da proteína do NC do WCLaV-1 e -2 de acordo com protocolo estabelecido pelo

laboratório de Virologia Geral da UnB utilizando a resina de Ni-NTA. Os antígenos purificados foram injetados em coelho, separadamente, por injeção com intervalo de 3 semanas, total de 3 injeções. A primeira injeção, o antígeno foi emulsificado com adjuvante Freund’s completo e as outras duas com adjuvante Freund’s incompleto. Os antissoros policlonais produzidos reagiram com proteínas expressadas e vírus semi-purificados, de 10 plantas infectadas de melancieiras com sintomas virais fortes coletados em Juazeiro, Bahia em 2019, por Dot-ELISA. O antissoro do WCLaV-1 reagiu mais especificamente com o WCLaV-1, mas não com o WCLaV-2. Entretanto, apesar do antissoro do WCLaV-2 reagir fortemente com o antígeno alvo, o antissoro apresentou fraca reação com WCLaV-1. Estes anticorpos foram testados utilizando amostras de melancieira estocadas no freezer -70 °C e inoculados mecanicamente, e reagiram em nível médio. As infecções foram confirmadas por RT-PCR e os resultados foram coerentes comparando-os por Dot-ELISA.