Caracterização do genoma do Papaya lethalyellowing virus e estudo da regulação gênica do Tomato bushy stunt virus

Abstract

O presente trabalho teve como objetivo principal obter o seqüenciamento do genoma do Papaya lethal yellowing virus (PLYV) para auxiliar na determinação da posição taxonômica desse vírus. Além disso, o trabalho visou o desenvolvimento de metodologias para o estudo do movimento de vírus em plantas e regulação gênica, sendo escolhido para esse fim, o sistema representado pelo TBSV, que apresenta características semelhantes ao PLYV. Na etapa de caracterização do genoma do PLYV (Capítulo I) foi sequenciado aproximadamente 70 % do genoma viral, representado por uma seqüência contínua de 3226 nucleotídeos. Duas possíveis ORFs principais puderam ser identificadas e foram denominadas ORF POL (provavelmente representando a polimerase viral) e ORF CP (provavelmente representando a proteína do capsídeo do PLYV). A disposição das ORFs e a presença de várias seqüências motivo conservadas, encontradas tanto na polimerase viral quanto na proteína do capsídeo do PLYV, foram as principais características observadas, que levaram a sugerir o PLYV como uma possível espécie pertencente a esse gênero. Entre essas regiões conservadas encontrou-se o motivo GDD (glicina-ácido-aspártico-ácido-aspártico), característico das RNAs polimerases dependentes de RNA que encontrou-se localizado na extremidade carboxil-terminal da polimerase. Além disso, essa seqüência apresentou homologia com as proteínas VPg e serinaprotease dos sobemovírus. Para a proteína VPg foi possível identificar também motivos conservados, como a seqüência consenso WAD (triptofano-alanina-ácido aspártico), seguida de uma região rica em D (ácido aspártico) e E (ácido glutâmico). Essa seqüência de aminoácidos antecede uma seqüência nucleotídica (UUUAAAC) indicadora da mudança de fase do ribossomo (ribossomal frameshift -1). A presença dessa seqüência conservada indica que, provavelmente, o PLYV também codifica a proteína VPg, presente em todos os sobemovírus. Na proteína do capsídeo do PLYV destacou-se a presença do motivo protéico MPYTVGTWLRGVASNWSK, conservado em todos os sobemovírus. Além dessas características moleculares, várias características biológicas como: círculo de hospedeiros restrito, possível transmissão via superfície das sementes e aspectos citopatológicos corroboram o relacionamento mais próximo do PLYV com membros do gênero Sobemovírus. Dados de microscopia eletrônica de transmissão de secções ultrafinas dos tecidos de raiz e folhas de plantas de mamão infectadas pelo PLYV revelaram a presença de grandes quantidades de vírus esféricos no citoplasma e no vacúolo de células infectadas. As partículas virais foram também observadas nos vasos do xilema, mas não nos tubos crivados ou vasos laticíferos. No vacúolo, as partículas de vírus apresentaram-se arranjadas de maneira helicoidal, formando estruturas tubulares. A maioria das hélices mostrou-se composta de cinco partículas por volta. Inclusões do tipo viroplasma, intercaladas com vírions, foram encontradas no citoplasma de algumas células. Partículas do PLYV puderam ser vistas no ápice das células da epiderme das raízes, o que pode explicar a possível transmissão desse vírus pelo solo. A natureza viral dessas partículas toi confirmada por experimentos de imunomarcação com ouro coloidal, usando-se o anti-soro específico anti-PLYV em meio LR-White. Assim, reuniu-se as características citopatológicas do PLYV com aquelas moleculares, para tentativamente sugeri-lo como uma possível espécie pertencente ao gênero Sobemovírus, contrariando as suposições anteriores, que sugeriram que o PLYV seria um tombusvírus. Mesmo assim, a elucidação completa do genoma deve ser concluída para que uma classificação definitiva seja apresentada para o PLYV. No capitulo II, o Tomato bushy stuní virus (TBSV) foi utilizado como um sistema para o estudo do mecanismo de tradução denominado “leaky scanning”. Nesse sistema, o início da tradução ocorre no segundo AUG, ao invés do primeiro códon de iniciação, como é conhecido para os mRNAs de eucariotos. Assim, para que um mRNA seja traduzido por “leaky scanning” o primeiro AUG deve estar sob a influência de um contexto subótimo, apresentar uma seqüência 5 ’ líder não traduzida pequena, ser destituído de estrutura secundária logo após o primeiro códon de iniciação AUG, além de que ambos devem estar relativamente próximos um do outro. O TBSV é um excelente sistema genético para o estudo desses fatores in vivo. A condição na qual duas fases abertas de leitura localizam-se na extremidade 3’ do genoma desse vírus (P19 e P22) e a posição dessas duas ORFs , é um forte indício de que o “leaky scanning” é o que rege a tradução dessas duas proteínas. Utilizando-se mutagênese via PCR e ensaios in vivo, analisou-se a importância da seqüência contexto em tomo do AUG de P22 na acumulação da proteína do capsídeo P41. Os resultados mostrados fortemente sugerem que a acumulação da proteína do capsídeo é afetada negativamente por mutações que redundam em uma seqüência contexto subótima em tomo do códon de iniciação da proteína P22 em relação ao vírus original, que conseqüentemente aumenta a expressão dessa proteína. Da mesma forma, a influência que o comprimento da seqüência líder, que antecede o códon de iniciação da proteína P22, exerce sobre a expressão de P22 e P19 foi analisado. O aumento do comprimento de 16 para 51 nucleotídeos resultou em uma alta taxa de expressão de P22. Porém, não se observou redução nos níveis de expressão de P19. Mesmo assim, os dados apresentados não descartam a hipótese de ser o “leaky scanning” o mecanismo que regula a expressão de proteínas localizadas na extremidade 3’ (P19 e P22) do TBSV.