Caracterização do efeito eletrofisiológico das mutações I1596S e V1627M em canais de sódio dependentes de voltagem associados à epilepsia e o efeito da toxina Tst2 isolada do escorpião Tityus stigmurus

Abstract

Os canais de sódio dependentes de voltagem (Nav) são responsáveis pela iniciação e propagação do potencial de ação. Esses canais são distribuídos por todo o corpo e possuem nove diferentes subtipos (Nav1.1-Nav1.9). Estruturalmente, possuem quatro domínios transmembrânicos, sendo que cada domínio possui seis αhélices (S1-S6) e duas ou três subunidades β. Mudanças na cinética desses canais podem ocorrer tanto devido a mutações nos genes que codificam os canais iônicos acarretando as canalopatias (por exemplo, a epilepsia e a arritmia) quanto por efeito de toxinas de animais (como a dos escorpiões). A epilepsia é uma doença causada por uma atividade elétrica anormal cerebral. Ela pode ser focal, generalizada, focal e generalizada combinados ou desconhecida. Infecções (viral ou bacteriana no cérebro), doenças autoimunes, causas adquiridas e mutações genéticas são as principais etiologias. Dentre as mutações, pode-se citar as ocasionadas nos genes que expressam canais iônicos dependentes de voltagem (Na+ , K+ , Ca2+ e Cl- ), como as no gene SCN2A que codifica o canal Nav1.2. A variante I1596S foi associada à epilepsia por causar convulsão neonatal infantil benigna (BFNIS); a variante V1627M está associada à epilepsia da infância com crises focais migratórias (EIMFS) e a variante L1650P foi descrita por estar relacionada à encefalopatia epiléptica infantil precoce (EIEE). Muito do que se conhece acerca da estrutura e função dos canais de Na+ se deu por meio do uso de ligantes específicos a essas proteínas, entre os quais as toxinas de escorpiões, em especial as que pertencem à família Buthidae. As espécies desta família são de maior importância médica pelo número e gravidade dos acidentes causando por suas espécies em humanos. A peçonha desses animais também tem se mostrado importante por seu potencial biotecnológico pela presença de moduladores de canais iônicos. A Tst2 é um peptídeo obtido na peçonha do escorpião Tityus stigmurus que possui alta porcentagem de identidade com peptídeos que possuem ação em canais de sódio dependentes de voltagem (NaScTxs). Os objetivos desse trabalho foram a avaliação do efeito das variantes patogênicas I1596S, V1627M e L1650P, associadas à epilepsia, na cinética dos canais Nav1.2 humanos mutados e a realização da caracterização eletrofisiológica do peptídeo Tst2 em canais Navs. Como resultado obteve-se que a cinética do canal com a variante I1596S teve a probabilidade de abertura na ativação alterada para potenciais mais hiperpolarizados e a probabilidade de abertura na inativação alterada para potenciais menos hiperpolarizados, e a mutação V1627M fez com que o canal Nav1.2 tivesse uma recuperação lenta da inativação mais acelerada que a do controle. Em relação a Tst2, a caracterização eletrofisiológica do efeito do peptídeo (100 nM) foi realizada nos canais de sódio dependentes de voltagem (Nav1.1-Nav1.7). Para a probabilidade de abertura na ativação, o canal mais afetado foi o Nav1.1 (com pré pulso) e Nav1.7 (sem pré pulso). Nav1.3 foi o mais afetado na probabilidade de abertura na inativação e Nav1.4 na recuperação da inativação lenta do canal. Não foram observadas alterações na inativação rápida de nenhum subtipo testado. O canal Nav1.2 é expresso no sistema nervoso central (predomínio nos neurônios glutamatérgicos). Dito isso, mutações no gene SCN2A que geram ganho de função podem acarretar a atividade elétrica anormal cerebral. Por fim, o peptídeo Tst2 possui alta porcentagem de identidade com peptídeos tanto alfa quanto beta. Após a caracterização eletrofisiológica pode-se observar apenas a atividade de beta toxina, sendo o efeito observado de deslocamento da probabilidade de abertura dos canais devido ao aprisionamento do sensor de voltagem do domínio II em um estado pré ativado. Além disso, foi observada a redução da macrocorrente devido à passagem de alguns canais do estado fechado diretamente para o estado inativado. A caracterização eletrofisiológica da cinética da variante L1650P ainda não foi realizada e o sequenciamento parcial do peptídeo Tst2 está sendo realizado em colaboração com o grupo do Prof Lourival Possani do Instituto de Biotecnologia da UNAM, México.