Análise metagenômica de sequências de vírus de plantas em água de esgoto e caracterização da ORFN1 putativa do pepper ringspot virus

Abstract

O monitoramento regular de vírus em espécies vegetais cultivadas é crucial para o manejo de fitoviroses. A identificação rápida e precisa de vírus que, potencialmente, apresentam alto risco pode auxiliar na prevenção de surtos epidêmicos severos em culturas de importância econômica. Atualmente, as tecnologias de High-Throughput Sequencing (HTS) tornaram-se uma ferramenta acessível e poderosa para essa finalidade. Entretanto, o método utilizado na coleta de amostras é um dos assuntos importantes ao se empregar esta tecnologia. Além disso, em muitos casos, o HTS é usado com amostras combinadas em forma de "pool", o que torna a mistura das amostras também uma discussão importante. Neste estudo, avaliamos o uso de amostras de águas residuais para monitorar vírus de plantas usando análise HTS e RTqPCR. Fitovírus pertencentes a 12 famílias foram encontrados em águas residuais, das quais Virgaviridae, Solemoviridae, Tymoviridae, Alphaflexiviridae, Betaflexiviridae, Closteroviridae e Secoviridae foram os mais abundantes, sendo representadas por mais de 20 espécies. Adicionalmente, um vírus quarentenário e uma possível nova espécie de tobamovírus foram descobertos. Foi analisada ainda a relevância de alimentos processados como fonte desses vírus em águas residuais. O pepper mild mottle virus foi detectado em abundância em amostras de alimentos processados à base de pimenta e amostras de água de esgoto, e o garlic common latent virus foi observado em menor quantidade em amostras de alho seco e fresco e amostras de água de esgoto. Esses dados sugerem uma alta correlação entre a abundância viral no esgoto e nas fontes de alimentos processados. O uso potencial de águas residuais para pesquisa de vírus é discutido neste estudo. Além do monitoramento de vírus, também é de grande importância o estudo de vírus já conhecidos que podem ter importância econômica não apenas no quesito fitossanitário, mas também tecnológico como o uso de clones infecciosos. O pepper ringspot virus (PepRSV) até o momento é o único tobravírus relatado no Brasil como patógeno de tomateiro e, principalmente, pimenteiro. No nosso laboratório, este vírus é utilizado como modelo para estudo da interação vírusplanta usando clones infecciosos, bem como vetor viral vegetal para expressão de proteínas recombinantes. Este trabalho também apresenta como objetivo o estudo de um gene putativo (ORFN1) do PepRSV. Construções virais contendo mutações na ORFN1 foram agroinfiltrados em folhas de Nicotiana benthamiana e sua expressão e localização subcelular foram demostradas a partir da fusão da proteína com proteínas de fluorescência por Western blotting e microscopia confocal. Sintomas distintos do tratamento controle (clone infeccioso sem mutações), como a ativação de lesões locais, murcha e tombamento, foram observados nas plantas inoculadas com os isolados mutantes. Finalmente, a ORFN1/GFP mostrou localização associada ao reticulo endoplasmático.