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Título : Análise metagenômica de sequências de vírus de plantas em água de esgoto e caracterização da ORFN1 putativa do pepper ringspot virus
Autor : Duarte, Macária Ferreira
Orientador(es):: Nagata, Tatsuya
Assunto:: Vírus de plantas
Esgotos
Localização intracelular
Fecha de publicación : 17-jun-2024
Citación : DUARTE, Macária Ferreira. Análise metagenômica de sequências de vírus de plantas em água de esgoto e caracterização da ORFN1 putativa do pepper ringspot virus. 2023. 93 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Microbiana) — Universidade de Brasília, Brasília, 2023.
Resumen : O monitoramento regular de vírus em espécies vegetais cultivadas é crucial para o manejo de fitoviroses. A identificação rápida e precisa de vírus que, potencialmente, apresentam alto risco pode auxiliar na prevenção de surtos epidêmicos severos em culturas de importância econômica. Atualmente, as tecnologias de High-Throughput Sequencing (HTS) tornaram-se uma ferramenta acessível e poderosa para essa finalidade. Entretanto, o método utilizado na coleta de amostras é um dos assuntos importantes ao se empregar esta tecnologia. Além disso, em muitos casos, o HTS é usado com amostras combinadas em forma de "pool", o que torna a mistura das amostras também uma discussão importante. Neste estudo, avaliamos o uso de amostras de águas residuais para monitorar vírus de plantas usando análise HTS e RTqPCR. Fitovírus pertencentes a 12 famílias foram encontrados em águas residuais, das quais Virgaviridae, Solemoviridae, Tymoviridae, Alphaflexiviridae, Betaflexiviridae, Closteroviridae e Secoviridae foram os mais abundantes, sendo representadas por mais de 20 espécies. Adicionalmente, um vírus quarentenário e uma possível nova espécie de tobamovírus foram descobertos. Foi analisada ainda a relevância de alimentos processados como fonte desses vírus em águas residuais. O pepper mild mottle virus foi detectado em abundância em amostras de alimentos processados à base de pimenta e amostras de água de esgoto, e o garlic common latent virus foi observado em menor quantidade em amostras de alho seco e fresco e amostras de água de esgoto. Esses dados sugerem uma alta correlação entre a abundância viral no esgoto e nas fontes de alimentos processados. O uso potencial de águas residuais para pesquisa de vírus é discutido neste estudo. Além do monitoramento de vírus, também é de grande importância o estudo de vírus já conhecidos que podem ter importância econômica não apenas no quesito fitossanitário, mas também tecnológico como o uso de clones infecciosos. O pepper ringspot virus (PepRSV) até o momento é o único tobravírus relatado no Brasil como patógeno de tomateiro e, principalmente, pimenteiro. No nosso laboratório, este vírus é utilizado como modelo para estudo da interação vírusplanta usando clones infecciosos, bem como vetor viral vegetal para expressão de proteínas recombinantes. Este trabalho também apresenta como objetivo o estudo de um gene putativo (ORFN1) do PepRSV. Construções virais contendo mutações na ORFN1 foram agroinfiltrados em folhas de Nicotiana benthamiana e sua expressão e localização subcelular foram demostradas a partir da fusão da proteína com proteínas de fluorescência por Western blotting e microscopia confocal. Sintomas distintos do tratamento controle (clone infeccioso sem mutações), como a ativação de lesões locais, murcha e tombamento, foram observados nas plantas inoculadas com os isolados mutantes. Finalmente, a ORFN1/GFP mostrou localização associada ao reticulo endoplasmático.
Abstract: Regular monitoring of viruses in cultivated plant species is crucial for the management of phytoviruses. The rapid and accurate identification of potentially high-risk viruses can help prevent severe epidemic outbreaks in economically important crops. Currently, High-Throughput Sequencing (HTS) technologies have become an accessible and powerful tool for this purpose. However, the method used in sample collection is one of the important issues when using this technology. Furthermore, in many cases, the HTS is used with pooled samples, which makes sample mixing an important issue as well. In this study, we evaluated the use of wastewater samples to monitor plant viruses using HTS analysis and RT-qPCR. Phytoviruses belonging to 12 families were found in wastewater, of which Virgaviridae, Solemoviridae, Tymoviridae, Alphaflexiviridae, Betaflexiviridae, Closteroviridae and Secoviridae were the most abundant, being represented by more than 20 species. Additionally, a quarantine virus and a possible new species of tobamovirus were discovered. The relevance of processed foods as a source of these viruses in wastewater was also analysed. Pepper mild mottle virus was detected in abundance in samples of pepper-based processed foods and in sewage water samples, and garlic common latent virus was observed in smaller amounts in dried and fresh garlic samples and in sewage water samples. These data suggest a high correlation between viral abundance in sewage and in processed food sources. The potential use of wastewater for virus research is discussed in this study. In addition to virus monitoring, it is also of great importance to study known viruses that may have economic importance not only in the phytosanitary aspect, but also technologically, such as the use of infectious clones. Pepper ringspot virus (PepRSV) so far is the only tobravirus reported in Brazil as a pathogen of tomato and, mainly, pepper. In our laboratory, this virus is used as a model to study the virus-plant interaction using infectious clones, as well as a plant viral vector for expression of recombinant proteins. This work also aims to study a putative gene (ORFN1) of PepRSV. Viral constructs containing mutations in ORFN1 were agroinfiltrated in leaves of Nicotiana benthamiana and their expression and subcellular localization were demonstrated from protein fusion with fluorescence proteins by Western blotting and confocal microscopy. Symptoms distinct from the control treatment (infectious clone without mutations), such as activation of local lesions, wilting and damping off, were observed in plants inoculated with the mutant isolates. Finally, ORFN1/GFP showed localization associated with the endoplasmic reticulum.
metadata.dc.description.unidade: Instituto de Ciências Biológicas (IB)
Departamento de Biologia Celular (IB CEL)
Descripción : Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2023.
metadata.dc.description.ppg: Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana
Licença:: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.unb.br, www.ibict.br, www.ndltd.org sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra supracitada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Aparece en las colecciones: Teses, dissertações e produtos pós-doutorado

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