LAMP colorimétrico específico para a detecção do enfezamento vermelho do milho usando uma região genômica exclusiva

Abstract

O Brasil se destaca por ser o terceiro maior produtor de milho no mundo, além de possuir autossuficiência no abastecimento nacional. Mesmo com a alta produção, o país possui em toda a sua extensão, condições climáticas que favorecem o ataque de diversos patógenos. O enfezamento vermelho do milho, causado pelo fitoplasma Maize bushy stunt phytoplasma (MBSP), é uma das doenças mais prejudiciais à cultura, diante disso, existe a demanda por métodos de detecção que sejam rápidos e acurados. A amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) é um desses métodos, sendo célere, sensível, com alta especificidade e podendo ser utilizada em análises a campo. O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de um protocolo de LAMP, através de genômica comparativa, para MBSP em milho. Para desenho dos conjuntos de primers foi utilizada a sequência do genoma completo do MBSP e demais sequencias de outros patógenos no software RUCS. Foi possível identificar 3706 sequencias core únicas, dessas, as 60 mais adequadas foram usadas para o desenho e síntese de três conjuntos de primers que apresentavam os critérios desejados. Uma coleção de 51 amostras de milho com e sem sintomas foram coletadas nos estados do Distrito Federal e Goiás, três dessas tiveram a região do 16S rRNA amplificadas, sequenciadas e confirmadas para a presença do MBSP através de análise filogenética. Para o teste do ensaio LAMP, o conjunto de primers mais promissor, 0_731_10_ID1, juntamente com o Kit Warmstart colorimetric LAMP 2X master mix (NEB) e as amostras positivas para MBSP foram usados para avaliação das melhores condições de reação. A proporção de primers internos e externos 1:4 e temperatura de 65 °C foram consideradas as mais adequadas e empregadas aos demais testes. A coleção de amostras foi testada com o nestedPCR com os primers P1/Tint e R16mF2/R16mR2 e comparada com o ensaio LAMP do presente trabalho. Considerando a presença e ausência de sintomas, ocorreu a confirmação de que as plantas sintomáticas eram positivas para o LAMP em maior proporção que para o nested-PCR. A sensibilidade do ensaio foi avaliada usando o produto de PCR com os primers externos F3/B3 purificado, quantificado e diluído de forma seriada em 10 concentrações. O ensaio LAMP proposto se mostrou sensível detectando até 0,1 de DNA. O uso de material vegetal diretamente na reação foi avaliado na mudança de cor do master mix e também para a inibição da reação. Foi identificado que não existem inibidores no tecido vegetal do milho.