Expressão heteróloga da enzima L-asparaginase de Fusarium proliferatum em sistema de expressão Escherichia coli BL21(DE3)

Abstract

A L-asparaginase é uma enzima com propriedades de hidrólise da L-asparagina, um aminoácido essencial para células neoplásicas e não essencial para o organismo humano e síntese de células normais, já que o organismo humano possui capacidade de síntese desse aminoácido, sendo convertida em ácido aspártico e amônia. Essa enzima é amplamente utilizada no tratamento de doenças linfoproliferativas e linfomas, com destaque para a Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), se tornando um dos principais agentes quimioterápicos dos últimos anos. A L-asparaginase atualmente aplicada nos esquemas terapêuticos são oriundas de microrganismos como Escherichia coli e Dickeya chrysanthemi, além da L-asparaginase PEGuilada que foi introduzida com o objetivo de diminuir a variedade de efeitos imunogênicos, neurotóxicos e de hipersensibilidade que os pacientes apresentam durante o tratamento oncológico, se tornando necessária a busca por novas fontes de produção da enzima. Portanto, esse trabalho avaliou a produção e atividade de L-asparaginase do fungo filamentoso do Cerrado brasileiro, Fusarium proliferatum, expressa em E. coli modificada pela deleção do gene nativo de L-asparaginase como hospedeira. A construção contendo o gene da L-asparaginase de F. proliferatum foi obtida utilizando o vetor de expressão pET-28a. A triagem de clones transformados resultou na seleção de um clone que foi utilizado ao longo de todo o trabalho, e a otimização de condições de cultivo revelou que a temperatura de 37 °C, utilizando uma concentração de 0.5 mM de IPTG foi a mais adequada para produção da enzima. A proteína foi extraída por metodologia de rompimento celular utilizando sonicador e analisada por eletroforese em gel de SDS-PAGE e Western blot. Os resultados evidenciaram o potencial para a expressão de uma proteína recombinante originária de um organismo eucarioto em um organismo procarioto, ressaltando a necessidade de otimização de processos e a importância dessas pesquisas no avanço do desenvolvimento de produtos biotecnológicos.