Produção, purificação e caracterização de L-asparaginase de Fusarium proliferatum DCFS10 em sistemas de tecnologia recombinante de Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris)

Abstract

A L-asparaginase é o principal componente terapêutico no combate à leucemia linfoblástica aguda. Essa enzima catalisa a reação de hidrólise do aminoácido L-asparagina em amônia e ácido aspártico e, a partir de uma diferença metabólica crucial, é capaz de exaurir os níveis extracelulares do aminoácido tornando inviável o crescimento das células tumorais. Disponível no tratamento de leucemia linfoblástica aguda desde a década de 60, a L-asparaginase é produzida atualmente por meio de tecnologia recombinante em sistemas de expressão de proteínas heterólogas de Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi, o que impacta diretamente no tratamento e no aparecimento de diversos efeitos adversos. Deste modo, a produção de L-asparaginase de organismos eucariotos poderia ser uma estratégia para diminuir os eventos adversos e aumentar a eficácia terapêutica do medicamento. Sendo assim o presente trabalho teve como objetivo principal a produção, purificação, e análise da citotoxicidade da L-asparaginase recombinante frente a linhagem celular de células neoplásicas Jurkat (ATTC TIB-152). Optou-se pela produção de proteínas heterólogas por Komagataella phaffii (Pichia pastoris) com a integração de uma sequência codificante para L-asparaginase do fungo Fusarium proliferatum, proveniente da biodiversidade brasileira (Bioma Cerrado). Paralelamente, um estudo in silico da sequência proteica foi realizado para obtenção de maiores informações da estrutura tridimensional da enzima. O RNA total fúngico foi primeiramente extraído e convertido em cDNA. Após verificação na literatura e estudo das sequências de L-asparaginase presentes em bases de dados, foi possível construir os primers para amplificação e reconhecimento da sequência codificadora de L-asparaginase desejada. A sequência codificadora foi clonada em vetor comercial pPICZαA e células de E. coli foram transformadas. Posteriormente à clonagem em E. coli, os vetores foram transformados em células de Komagataella phaffii X-33 (Pichia pastoris X-33). Foram obtidos 21 transformantes, os quais foram testados quanto à produção de L-asparaginase, sendo que a maior atividade enzimática encontrada intracelularmente foi expressa no transformante 9 (2,84 UI/g). Visando um processo de purificação, a enzima foi extraída com a utilização de sonicador de ponteira e em seguida submetida à coluna de troca iônica DEAE FF 5 mL. Os resultados demonstram uma enzima parcialmente purificada que apresenta pH ótimo em torno de 7,0, temperatura ótima de 40 ºC e Km e Vmax nos valores de 17,44 mM e 5,35 mM/s-1 , respectivamente. A análise in silico pôde prever estruturas monoméricas com certo grau de confiabilidade, além disso apresentou resíduos de aminoácidos conservados em diferentes posições, confirmando a importância desses resíduos na atividade catalítica da enzima. Com relação aos ensaios de viabilidade celular, a L-asparaginase produzida neste trabalho demonstrou alta eficácia frente às células neoplásicas testadas em 24 horas de tratamento. Foi possível confirmar a integração da sequência codificadora de L-asparaginase de F. proliferatum no DNA genômico de K. phaffii X-33, a produção de uma enzima funcional parcialmente purificada, estável em pH próximo ao fisiológico, com atividade citotóxica frente a células de linhagem Jurkat, com amplo potencial para aplicação terapêutica. Como perspectiva, destaca-se a necessidade de avaliar e otimizar as condições de cultivo para uma produção industrial.