Avaliação da atividade modulatória de diferentes classes químicas frente a expressão de fenótipos de Quorum Sensing de uma cepa de Chromobacterium

Abstract

Quorum Sensing (QS) é um processo de comunicação bacteriana responsável por controlar a expressão de diversos fenótipos como bioluminescência, produção de metabólitos, ativação de mecanismo de defesa, entre outros. Ele acontece por meio de autoindutores (AI), que podem se apresentar como moléculas pequenas ou como peptídeos. Dessa forma, a manipulação dessa comunicação é estudada a fim de se obter respostas desejadas de comportamentos bacterianos. A cepa CV026 é um conhecido modelo de comunicação bacteriana e foi escolhida para a execução deste trabalho devido à resposta visual de seu fenótipo controlado por QS, a produção de violaceína. No capítulo 1 desse trabalho, foram implementados experimentos biológicos com CV026 que permitiram avaliar a modulação do seu QS: a quantificação de produção de violaceína e o consumo de quitina, ambos fenótipos controlado por QS em CV026. Experimentos voltados a se entender o mecanismo de ação de moléculas moduladoras desses fenótipos também foram implementados: ensaio de competição pela proteína receptora do autoindutor de CV026, a CviR; e ensaio de quantificação de genes controlados por QS. No capítulo 2 foram estudadas N-(2-hidroxietil)amidas e morfolinamidas planejadas racionalmente como simplificação estrutural do autoindutor do QS da cepa CV026 e de um conhecido inibidor deste QS. De forma geral, as N-(2-hidroxietil)amidas e as morfolinamidas inibiram em até 50% a produção de violaceína em uma concentração de 1,25 mM e 2,5 mM respectivamente. Ensaios computacionais de docking molecular do complexo entre essas moleculas e a CviR mostraram que elas se posicionam preferencialmente no domínio de ligação do AI em uma pose semelhante ao AI. N-(2-hidroxietil)amidas e morfolinamidas baseadas na estrutura do inibidor utilizado como controle positivo de inibição apresentaram uma perda considerável de sua inibição. Duas moléculas baseadas na hibridização molecular entre a N-(2-hidroxietil)amida mais ativa e o controle positivo de inibição apresentam resultados similares aos apresentados pelas suas moléculas originais. As duas moléculas deste capítulo que apresentaram os melhores resultados de inibição tiveram seu mecanismo de ação estudado. Apesar de não aparentarem inibição do consumo de quitina, no experimento de competição pelo sítio ativo da proteína, as duas moléculas conseguiram manter 50% de inibição da produção de violaceína mesmo com a duplicação da concentração do AI, porém a síntese de violaceina foi reestabelescia em concetrações acima de 200 μM. O experimento de RT-qPCR permitiu confirmar que a inibição apresentada por essas moléculas acontece em nivel transcricional. No capítulo 3, foi estuda uma cromenona anteriormente identificada como inibidora do QS em Vibrio harveiy bem como algumas impurezas relacionadas à sua síntese e degradação. A cromenona e uma impureza de síntese apresentaram resultados iguais de inibição na mesma concentração de teste, 65% a 625 μM. No teste de competição pela CviR, a cromenona apresentou a melhor inibição da síntese de violaceina mesmo com o aumento da concentração do AI. Não foi observada diminuição no consumo de quitina. Contudo, o experimento de RT-qPCR permitiu confirmar que a inibição observada acontece em nível transcricional. Por fim, no capítulo 4, algumas δ-valerolactonas foram estudadas frente ao QS de CV026. A molécula mais ativa apresentou 85% de inibição de síntese de violaceína em 625 µM. O experimento computacional de docking molecular apresentou esta molécula no domínio de ligação do AI, mas invertida com relação à pose do AI. Esta substância também apresentou o melhor resultado no experimento de competição mantendo 50% de inibição de violaceína mesmo com o aumento de 2000 vezes da concetração de AI, além de inibir o consumo de quitina. Por fim, o experimento de RT-qPCR permitiu confirmar que essa molécula inibe o QS de CV026 em nível transcricional.