Desenvolvimento de reação isotérmica do tipo LAMP usando genômica comparativa para a detecção do patógeno bacteriano Erwinia psidii

Abstract

A seca dos ponteiros, doença bacteriana causada por Erwinia psidii, é considerada uma importante doença da cultura da goiabeira (Psidium guajava L.) e do eucalipto (Eucalyptus spp.), chegando a causar entre 30 e 85% de perdas, é um dos principais fatores limitantes da produção. Uma vez que a principal forma de disseminação da doença é através de material vegetal propagativo assintomático, métodos sensíveis, rápidos e acurados para a detecção do patógeno em plantas assintomáticas são necessários para a diagnose precoce. Assim, o objetivo deste trabalho consiste no desenvolvimento de um ensaio de detecção molecular de amplificação isotérmica (LAMP) para detecção de Erwinia psidii na cultura da goiaba e do eucalipto. Em busca de regiões genômicas exclusivas para E. psidii, foi realizada a análise de genômica comparativa com o software RUCS, comparando as sequências do alvo juntamente com as regiões de diversos agentes fitopatogênicos que acometem as culturas da goiaba e do eucalipto. Das 842 regiões exclusivas, somente as cinco com maior potencial foram usadas para o desenho de conjuntos de primers. Além dessas, a região recA, anteriormente usada para o desenvolvimento de primers específicos para PCR convencional e qPCR, também foi selecionada. Os sete conjuntos de primers foram desenhados na plataforma NEB® LAMP Primer Design Tool. A verificação de compatibilidade dos primers foi realizada utilizando o isolado tipo IBSBF435, onde foram avaliadas duas temperaturas (60 e 65 ºC) e seis intervalos de tempo (30, 40, 50, 55, 60 e 75 minutos). A temperatura de 65 ºC, com mudança de cor para quatro dos sete conjuntos, a partir de 50 minutos. Em seguida, foi realizado um ensaio para examinar a proporção entre primers internos e externos para aprimorar o LAMP. A proporção 8:1 (mais diluído) foi capaz de resultar em amplificação três dos quatro conjuntos, enquanto na concentração de 4:1, todos os quatro conjuntos foram capazes de amplificação. A sensibilidade do conjunto de primers mais promissor (Ep19) foi testada com seis diluições do DNA extraído do isolado tipo, entre 10 e 1x10-5 ng.µL-1 . O ensaio alcançou a sensibilidade para detectar até 1x10-4 ng.µL-1 . O ensaio LAMP desenvolvido neste estudo demonstrou ser um método rápido e eficaz para a detecção de Erwinia psidii em laboratório, além de detectar o DNA de E. psidii em baixas concentrações, demonstrando uma alta sensibilidade.