Quinoleínas substutuídas na posição 2 com potencial leishmanicida : seleção de um composto promissor para o desenvolvimento clínico

Abstract

Um estudo etnofarmacológico realizado com as plantas tradicionalmente usadas na Bolívia para curar lesões da leishmaniose cutânea conduziu à descoberta da espécie Galipea longiflora . As purificações bioguiadas a partir da casca do caule, da casca da raiz e das folhas do arbusto conduziram ao isolamento de uma nova família de alcalóides, as quinoleínas substituídas sobre o carbono da posição 2. Algumas destas substâncias eram inéditas e foram chamadas chimaninas em homenagem aos índios Chimanos. Dos doze alcalóides testados em camundongos infectados por L. amazonensis ou L. venezuelensis , a 2-n-propilquinoleína e as chimaninas B e D se revelaram tão ou mais ativas que o medicamento de referência, o Glucantime®. Estes resultados interessantes foram patenteados pelo Institut de Recherche pour le Développement (IRD) juntamente com os colaboradores bolivianos. A partir de 1994, estes compostos começaram a ser sintetizados em laboratório e foram testados sobre diversos microrganismos. As quinoleínas que apresentaram os melhores resultados em estudos in vitro e in vivo de leishmaniose: 2-npropilquinoleína (composto 1), 2-(2 metoxietenil) quinoleína (composto 2) e 2-(2- hidroxiprop-2-enil) quinoleína (composto 3), foram escolhidas para este trabalho de tese que teve o objetivo de selecionar o composto mais promissor para o desenvolvimento clínico. O estudo de ação in vitro sobre promastigotas de Leishmania donovani mostrou que o composto 1 apresenta fraca atividade com IC50 > 100 μM sobre todas as cepas. Os compostos 2 e 3, ao contrário, apresentaram boa atividade com concentrações inibitórias mais baixas que a sitamaquina, uma 8- aminoquinoleína, sobre todas as cepas testadas. No estudo de interação in vitro não houve sinergismo das associações estudadas. O composto 1 foi o mais estável no ensaio de estabilidade química e o composto 2, o menos estável, demonstrando a formação de vários produtos de degradação. O estudo de toxicidade aguda com os compostos 1 e 2 mostrou sinais reversíveis sobre o comportamento dos animais nas doses mais elevadas. Porém, nada foi observado nos grupos tratados com 100 mg/kg e 10 mg/kg. Não houve diferenças significativas nos resultados das análises bioquímicas. Após estes ensaios, o desenvolvimento do composto 1 foi priorizado e, para solucionar problemas de solubilidade e volatilidade desta molécula, uma nova formulação foi sintetizada. Então, a biodisponilidade do composto 1 foi avaliada após administração intravenosa mostrando um decaimento biexponencial rápido com meia-vida de distribuição de 4,6 min e meia-vida de eliminação de 58,7 min. Os resultados dos testes de atividade in vitro e biodisponilibidade sugerem que o composto 1 é uma pró-droga. Com base no histórico das quinoleínas e nos resultados obtidos neste trabalho, o composto 1 foi selecionado como a molécula mais promissora para o tratamento da leishmaniose. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

An ethnopharmacological study carried out with some medicinal plants used to treat cutaneous leishmaniasis conducted to the discover of Galipea longiflora. Bioguided studies of the root barks, stem barks, and leaves conducted to the isolation of a new family of alkaloids, the 2-substituted quinolines. Some of these substances were unpublished and were called chimanines in honor of the Chimano Indians. From the twelve alkaloids tested in mice infected by L. amazonensis or L. venezuelensis , the 2-n-propylquinoline and chimanines B and D were revealed more or as active as the reference medicine, Glucantime®. These interesting results were patented by the Institut de Recherche pour le Développement (IRD) together with colombian coworkers. Since 1994, these compounds are synthesized in laboratory and are tested on several microorganisms. The most active quinolines in in vitro and in vivo studies of leishmaniasis: 2-n-propylquinoline (compound 1), 2- (2methoxyethenyl)quinoline (compound 2) and 2-(2-hydroxyprop-2-enyl)quinoline (compound 3) were chosen for this thesis. In the present study, further experiments were performed in order to choose the most promising compound as a potential drug candidate for the development of a new oral therapy. Compound 1 exhibited a weak IC50 value in the in vitro activity test. Compounds 2 and 3 were more active than sitamaquine, a 8-aminoquinoline, against all tested strains. In vitro interactions showed no synergism for compound 1 combined with the other compounds or reference drugs. Compound 1 was the most stable molecule in various solutions whereas compound 2, the most unstable, displayed new peaks in chromatograms ascribable to degradation products. Reversible side effects were observed after oral administration of compounds 1 and 2 at 1000 mg/kg but nothing was detected at 100 mg/kg and 10 mg/kg. Biochemical data did not show any significant modification. After these previous results, compound 1’s development was focused and, in order to solve solubility and volatility problems, a new formulation salt has been created. A bioavailability study of intravenously administered compound 1 showed that concentrations of the compound 1 in plasma declined rapidly in a bi-exponential manner. Distribution half-life and elimination half-life were 4,6 min and 58,7 min, respectively. In vitro activity and pharmacokinetic results indicate that compound 1 could act as a prodrug. The results from this and previous studies allow to conclude that compound 1, the first 2-substituted quinoline isolated from Galipea longiflora , is presently the most promising molecule from this series for further preclinical development work. ________________________________________________________________________________________ RÉSUMÉ

Les leishmanioses sont des affections cutanées ou viscérales dues à des protozoaires flagellés appartenant au genre Leishmania et transmises par la piqûre de certaines espèces de phlébotomes du genre Lutzomyia dans le Nouveau monde et Phlebotomus dans l’Ancien monde. Les leishmanioses sont présentes dans les zones tropicales et subtropicales de 88 pays. La prévalence globale de cette maladie est estimée à 12 millions de personnes touchées dans le monde, avec 2 millions de cas nouveaux chaque année. Un autre facteur important est venu s’ajouter; la leishmaniose viscérale figure dans les maladies opportunistes chez les malades touchés par le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA). Comme beaucoup de maladies dans les pays en voie de développement, il manque de médicaments efficaces et accessibles et le parasite ou les insectes vecteurs deviennent de plus en plus résistants aux molécules anti-parasitaires existantes. Les traitements employés contre les leishmanioses font appel à des produits généralement assez toxiques comme des dérivés antimoniés (Glucantime® ou Pentostam®), l’amphotéricine B ou la pentamidine. Ces médicaments sont peu maniables; ils doivent être administrés par voie injectable et ils présentent des effets secondaires importants qui nécessitent souvent une hospitalisation et l’attention d’un personnel compétent pour effectuer les perfusions. La miltéfosine, première molécule active par voie orale, génère des résistances in vitro chez les parasites. La recherche de nouvelles molécules thérapeutiques s’avère par conséquent nécessaire. Les plantes représentent des sources importantes de nouveaux composés et sont généralement utilisées par les populations qui vivent dans les zones d’endémies lointaines des centres de santé. Des études ethnopharmacologiques ont été entreprises dans ce sens par des chercheurs de l’IRD en Amérique du Sud. Ces derniers, en collaboration avec des chercheurs du CNRS et de l’université Paris-Sud, ont ainsi découvert et étudié des alcaloïdes de la famille chimique des quinoléines, dotés de propriétés antiparasitaires. Ces molécules, obtenues par synthèse chimique, sont des analogues de quinoléines isolées initialement d’une plante bolivienne, Galipea longiflora (Rutaceae). Parmi ces molécules, certaines se sont révélées particulièrement actives contre les parasites du genre Leishmania, présentant une efficacité égale ou supérieure à celle du médicament de référence pour traiter les leishmanioses, le glucantime®. Les trois quinoléines les plus prometteuses, la 2-n-propylquinoléine (composé 1), la 2 - (2 méthoxyethényl) quinoléine (composé 2) et la 2-(2-hydroxyprop-2-enyl) quinoléine (composé 3) ont été choisies pour ce travail de thèse. L’objectif a été de comparer ces molécules afin de sélectionner l'un d'eux pour un prédéveloppement clinique. L’activité antileishmanienne in vitro sur les formes promastigotes sauvages et chimiorésistantes de Leishmania donovani a montré que le composé 1 est peu actif in vitro (CI50 > 100 μM) quelque soient les souches. Les composés 2 et 3, par contre, ont présenté des CI50 in vitro plus basses que celle du produit de référence, la sitamaquine, une amino-8-quinoléine, sur toutes les souches étudiées. Ils sont également plus actifs que la miltéfosine sur la lignée HePC-résistante. L’étude d'association de chacun des trois composés avec des antileishmaniens de référence a été réalisée in vitro afin de rechercher une synergie d'action mais les associations n'ont montré qu'un effet additif. Un essai de stabilité chimique des quinoléines a été réalisé dans différentes solvants et conditions de température et de luminosité. Chacun des composés a ainsi été étudié dans le méthanol, le diméthylsulfoxide, le PBS à pH 7, l'acide camphosulfonique à pH 2 ou un mélange de carboxymethylcellulose/tween 80 à 4°C, à température ambiante sous influence de la lumière ou à temperature ambiante à l’obscurité pendant 9 jours. Le composé le plus stable dans ces conditions a été le composé 1. Le composé 2 s'est avéré le moins stable et les chromatogrammes ont montré l'existence de produits de dégradation. L’étude de toxicité aigue a été réalisée sur les composé 1 et 2 chez les souris CD-1 à 1000, 100 et 10 mg/kg. Les composés ont été administrés en dose unique par voie orale et le comportement des animaux a été observé sur 14 jours. Des signes de toxicité comportementale réversible ont été observé après l’administration de 1000 mg/kg des composés mais aucun signe n'a été détecté à 100 et 10 mg/kg. Les analyses biochimiques du sang prélevé au dernier jour après l’administration, a permis de noter aucune modification significative sur les marqueurs de toxicité hépatique et rénale. Aprés les résultats ci-dessus, le développement du composé 1 a été priorisé. Le composé 1 est le composé naturel qui présente une grande facilité de synthèse et est stable dans les milieux évalués. Mais, ce composé est une molécule apolaire basique, volatile et huileuse qui présente des problèmes de solubilité un milieu aqueux. Ainsi, L'étape suivante a consisté à préparer une formulation d'un sel cristallin du composé 1 qui permettent la préparation de comprimés pour l'administration orale. La préparation de cette formulation et sa caractérisation par microscopie optique et diffraction aux rayons X a fait l'objet d'un dépôt de brevet français en avril 2008. La dernière partie du travail a consisté à étudier la biodisponibilité du composé 1 chez les rats Wistar par voie intraveineuse. Les résultats obtenus après administration intraveineuse chez le rat montrent une décroissance en 2 étapes. La première, très rapide, d’une demi-vie de 4,6 minutes correspond à la distribution, la fixation aux protéines et aux éléments figurés du sang ainsi qu’à la captation tissulaire. La seconde, plus lente, d’une demivie de 58,7 minutes correspond à la phase d’élimination. Cependant, le composé reste très actif à la dose administrée, ce qui suggère la présence d’un métabolite actif qui n'a pas encore été identifié. L'ensemble des résultats présentés dans cette thèse permet de conclure que le composé 1 est actuellement la molécule la plus prometteuse de cette série pour le traitement de la leishmaniose.