Efeito da estimulação ovariana na quantidade e qualidade de ovócitos obtidos por aspiração folicular transvaginal em novilhas nelore

Abstract

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da estimulação ovariana na quantidade e qualidade de ovócitos obtidos por aspiração folicular transvaginal (OPU) em novilhas Nelore. Foram utilizadas 27 novilhas cíclicas da raça Nelore, sendo que todos os animais passaram pelos três tratamentos em delineamento “cross-over”. Os animais foram sincronizados e no D6 após a manifestação do cio foi realizada a ablação dos folículos ≥ 5mm de diâmetro, com colocação de implante intravaginal de progesterona e aplicação de prostaglandina F2α,. Nos animais do grupo controle (Tc) a OPU foi realizada no D12 após estro; no grupo SOV-LH (T1) no D8 após estro teve início a administração de FSH (162 UI-PLUSET ®) em 6 doses decrescentes de 12 em 12 horas, e a OPU foi realizada 36 horas após a última aplicação de FSH, sendo que 6 horas antes da OPU os animais receberam uma aplicação de 25mg de LH; no grupo SOV (T2) os animais receberam o mesmo tratamento do T1, porém sem aplicação de LH. No momento da OPU os folículos foram contados, classificados pelo tamanho em > 6 mm e < 6 mm e aspirados separadamente de acordo com o tamanho. Os CCOs recuperados foram classificados de acordo com a qualidade morfológica (1-4) e os de qualidade grau 1,2,3 foram utilizados para a PIV. Um total de 833 ovócitos foram maturados e fecundados in vitro, sendo que a taxa de clivagem foi avaliada no D2 (48h após a inseminação) a taxa de blastocisto avaliada nos dias 6,7,8 e a taxa de eclosão no dia 8. Para detectar a existência de efeito do tamanho dos folículos (>6 mm e <6 mm) e tratamentos hormonais (Tc, T1, T2), bem como suas interações sob a taxa de ovócitos recuperados e produção de embriões foi utilizado o modelo linear generalizado misto (MLGM). Para o número de folículos aspirados, ajustou-se um modelo linear generalizado misto família quase Poisson, com função de ligação log, para analisar a taxa de eclosão foi utilizado o modelo linear generalizado família binomial. Os resultados indicaram que o tratamento T2 (8,5 ± 5,5) apresentou número médio de ovócitos recuperados maior (P<0,05) do que o T1 (7,2 ± 4,3) e o Tc (6,7 ± 4,3). Quando as médias foram avaliadas por tamanho de folículo, foi observado número médio de ovócitos recuperados a por sessão maior (P<0,05) nos folículos <6 mm (9,3 ± 5,4) em comparação aos >6 mm (5,7 ± 3,2). O número de folículos <6 mm foi maior (P<0,05) no Tc (34,8 ± 16,3) em relação ao T1(8,5 ± 8,6) e T2 (10,1 ± 7,6), e estes foram semelhantes (P>0,05). Já para folículos >6mm um maior número foi observado no T1(23,5 ± 11,5) e T2 (19,1 ± 6,8) em comparação ao Tc (1,8 ± 1,4) (P<0,05). A produção de ovócitos de qualidade I, II e III de folículos < 6mm, foi maior no Tc em comparação aos tratamentos T1 e T2 (P<0,05). Para folículos < 6mm o T2 produziu mais ovócitos de qualidade I em média, 2,62 vezes maior (P<0,05) em relação ao T1. O contrário ocorreu na produção de ovócitos de qualidade I, II e III de folículos >6mm onde T1 e T2 foram semelhantes, porem produziram mais ovócitos que Tc (P<0,05). Os resultados mostraram que a taxa de blastocisto não diferiu entre os tratamentos (P>0,05) quando apenas os folículos menores do que 6 foram avaliados, sendo 31,2±12,2%, 31,0±16,9% e 24,3±14,1% para Tc, T1 e T2, respectivamente. Entretanto, quando o tamanho do folículo >6mm foi considerado, um aumento (P<0,05) na taxa de blastocistos foi observada nos tratamentos T1 (47,8±21,2%) e T2 (39,1±19,8%) em relação ao Tc (22,2±44,1%). O efeito do tratamento hormonal na produção embrionária também foi detectado quando a análise global foi realizada independente do tamanho do folículo, sendo a taxa de blastocisto maior (P<0,05) no T1 (39,4±20,5%) e T2 (31,7±18,4%) em relação ao Tc (26,7±31,7%). A taxa de eclosão foi semelhante entre todos os tratamentos considerando ou não o tamanho folicular (P>0,05). A superestimulação ovariana, com ou sem aplicação de LH, aumentou a produção de embriões in vitro em novilhas Nelore. Portanto a aplicação de FSH na onda sincronizada para aspiração folicular pode ser uma alternativa viável para a produção comercial de embriões in vitro. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the effect of ovarian stimulation in quantity and quality of oocytes obtained by ovum pick up (OPU) in Nellore heifers. Twenty seven Nellore cyclical heifers were used in a cross-over experimental design, where all the animals passed by each of the three treatments. All animals were sincronized and on D6 after estrus detection the ablation of follicles ≥ 5 mm in diameter was performed and the animals received an intravaginal implant of progesterone and an application of prostaglandin F2α. In the animals of the control group (Tc) the OPU was performed on D12 after estrus; in the group SOV-LH (T1) on D8 after estrus, it has started the administration of FSH (162 UI-PLUSET ®) in 6 decreasing doses of 12 to 12 hours, the OPU was performed 36 hours after the last application of FSH and, 6 hours before OPU the animals received one application of 25 mg of LH; in the group SOV (T2) the animals received the same treatment as T1, but without the application of LH. At the time of OPU follicles were counted and classified by the size in > 6 mm and <6 mm, and then were aspirated separately. The recovered COCs were classified according to morphological quality (I-IV) to quality in grade I, II, III and were used for IVP. A total of 833 oocytes were matured in vitro, cleavage rate was evaluated on D2 [48 h post insemination (pi)] and blastocyst rate on day 6, 7 and 8 pi, being the hatching rate evaluated on D8 pi. To detect effect of the follicles size (> 6 mm and <6 mm) and hormonal treatments (Tc, T1, T2) and their interactions in the rate of retrieved oocytes and embryo production the generalized linear mixed model (MLGM) with normal distribution and log link function was used. For the number of aspirated follicles, a generalized linear mixed model almost Poisson family was adjusted with log link function. To analyze the hatching a generalized linear model binomial family was used. The results indicated that in T2 treatment (8.5 ± 5.5) a higher number of oocyte was recoverd (P<0.05) than in T1 (7.2 ± 4.3) and Tc (6.7 ± 4.3). When the means were evaluated by follicles size, it was observed a higher number of oocytes per session (P<0.05) in follicles <6 mm (9.3 ± 5.4) compared to >6 mm (5.7 ± 3.2). The number of follicles <6 mm was higher (P <0.05) in Tc (34.8 ± 16.3) compared to T1 (8.5 ± 8.6) and T2 (10.1 ± 7.6), which were similar between them (P>0.05). For follicles > 6 mm a larger number was observed in T1 (23.5 ± 11.5) and T2 (19.1 ± 6.8) compared to Tc (1.8 ± 1.4) (P<0.05). On follicles <6 mm, higher number of oocytes grade I, II and III were recovered in Tc compared to treatments T1 and T2 (P<0.05). For follicles <6 mm the T2 produced more oocytes quality I, being 2.62 times higher (P<0.05) than T1. In contrast, for follicles > 6 mm number of oocytes grade I, II and III was similar between T1 and T2, but it was lower in Tc (P<0.05). The results showed that the blastocyst production did not differ between treatments (P>0.05) when only the follicles smaller than 6 mm were considered, being 31.2 ± 12.2%, 31.0 ± 16.9% and 24.3 ± 14.1% for Tc, T1 and T3, respectively. However, when only follicle > 6 mm were considered, an increase (P<0.05) in blastocyst rate was observed in T1 treatments (47.8 ± 21.2%) and in T2 (39.1 ± 19.8%) compared to Tc (22.2 ± 44.1%). The effect of hormonal treatment on blastocyst production was also detected when a global analysis was conducted independent of follicle size, being the blastocyst rate higher (P<0.05) in T1 (39.4 ± 20.5%) and T2 (31.7 ± 18.4 %) than in Tc (26.7 ± 31.7%). The hatched rate was similar among all treatments considering or not the follicular size (P>0.05), in the general analysis the hatched rate was similar for Tc (39.0±12.2%), T1 (38.7±25.3%) and T2 (35.524.1%). The ovarian stimulation, with or without application of LH, increased the in vitro production of embryos in Nellore heifers. Therefore the application of FSH in the synchronized wave for follicular aspiration may be a viable alternative to the commercial production of embryos in vitro.