Estudo dos componentes protéicos da peçonha da serpente Micrurus frontalis (serpentes: elapidae)

Abstract

As serpentes corais pertencentes ao gênero Micrurus possuem uma peçonha rica em proteínas e peptídeos biologicamente ativos. No entanto, estudos bioquímicos e farmacológicos com os componentes desses venenos são escassos devido à grande dificuldade de coleta, manutenção em cativeiro das serpentes e a pequena quantidade de veneno obtida em cada extração. O presente estudo descreve o isolamento, a determinação da massa molecular e o seqüenciamento completo e parcial de algumas moléculas biologicamente ativas presentes no veneno de Micrurus frontalis. Os componentes foram purificados após vários passos de fracionamento em cromatografia líquida de fase reversa. A pureza e as massas moleculares foram determinadas por espectrometria de massa de tipo MALDI-TOF e electrospray (ESI). As sequências de aminoácidos dos componentes nativos e dos peptídeos gerados após proteólise foram determinadas por degradação de Edman e sequenciamento De novo. Foram identificadas toxinas da família de três-dígitos, PLA2 e waprinas. As toxinas do tipo três dígitos receberam o nome de Frontoxinas (FTx) I a VI. As FTx I, II, III e VI possuem 4 ligações dissulfeto conservadas e são estruturalmente similares às ?-neurotoxinas de cadeia curta. Já as FTx IV e V apresentaram alta similaridade com ?-neurotoxinas de cadeia longa, com 10 resíduos de cisteína conservados. Quando aplicadas em junção neuromuscular de rã, as FTx II, III e IV reduziram a amplitude dos potenciais de ação em miniatura de maneira tempo- e concentração-dependente, sugerindo que essas FTxs bloqueiam os receptores nicotínicos de acetilcolina. As PLA2 foram identificadas após o sequenciamento de fragmentos, os quais apresentaram alta similaridade com PLA2 de elapídeos. Uma nova família de proteínas ofídicas, a waprina, foi encontrada na peçonha de M. frontalis. Esta toxina, pouco abundante no veneno, possui quatro ligações dissulfeto conservadas e recebeu o nome de Miwaprina, em virtude da alta identidade com waprina de Naja nigricollis. As FTx I, V, VI, as PLA2s e a Miwaprina, não foram submetidas à testes biológicos devido à quantidade insuficiente de amostra purificada. Este trabalho corresponde ao primeiro estudo de caracterização da estrutura primária e biológica de componentes isolados a partir do veneno de M. frontalis, abrindo perspectivas não só para a identificação dos demais componentes, como também do provável papel dos mesmos na captura de presas e nos envenenamentos. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT

Coral snakes (Micrurus genus) venoms contain a wide spectrum of biologically active proteins and peptides. The major obstacle to study Micrurus venoms is the small amount of material that can be collected. Therefore, the biochemistry and pharmacology of components from coral snakes venoms are mostly unknown. In this study we describe the isolation, molecular mass determination, complete and partial amino acid sequencing of short and long -chain three-finger toxins, PLA2 and waprin isolated from Micrurus frontalis venom. Components were purified using multiple steps of RP-HPLC. Molecular masses were determined by MALDI-TOF and ESI ion-trap mass spectrometry. The amino acid sequences of toxins were determined by sequencing of overlapping proteolytic fragments by Edman degradation and by De novo sequencing. The three-finger toxins were named Frontoxin (FTx) I-VI. The amino acid sequences of FTx I, II, III and VI predict 4 conserved disulphide bonds and structural similarity to previously reported short-chain -neurotoxins. FTx IV and V each contained 10 conserved cysteines and share high similarity with long-chain - neurotoxins. At the frog neuromuscular junction FTx II, III and IV reduced miniature endplate potential amplitudes in a time-and concentration-dependent manner suggesting Frontoxins block nicotinic acetylcholine receptors. Fragments of isolated PLA2 were determined and share high similarity scores with PLA2 from other Elapids. The waprin member possesses four conserved disulfide bonds and showed high identity with waprin from Naja nigricollis venom. Because of the significant sequence similarity with WAPs, the molecule was named Miwaprin. Due the insufficient amount of purified FTx I, V, VI, PLA2s and Miwaprin, these toxins were not submitted to the biological assays. These are the first complete primary structure characterization of M. frontalis snake venom toxins.