Resolução da estrutura tridimensional do inibidor tríptico e quimotrípico de Vigna unguiculata em complexos binário e ternário

Abstract

O inibidor BTCI (Black-eyed pea Trypsin and Chymotrypsin Inhibitor) foi isolado de Vigna unguiculata, purificado e cristalizado em complexos binário com -tripsina e ternário com -tripsina e -quimotripsina em pH 4,5 e 7,5. Os dados cristalográficos foram coletados no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS). A estrutura cristalográfica foi resolvida em 1,55 Å para o complexo binário com tripsina e 1,70 Å (pH 7,5) e 1,63 Å (pH 4,5) para o ternário pelo método de substituição molecular utilizando a estrutura do inibidor de Phaseolus angularis (PDB 1tab) como modelo. O modelo final do complexo binário obtido após o refinamento foi depositado no PDB com o código 2G81, apresentando qualidade estrutural conforme indicado pelos valores de Rfactor de 0,154 e Rfree de 0,169 e os parâmetros estereoquímicos dentro da faixa de modelos de alta resolução estrutural. Similarmente o modelo do complexo ternário apresentou qualidade estrutural em pH 7,5 e 4,5 conforme indicado pelos valores baixos de Rfactor = 0,171 e 0,168; Rfree = 0,218 e 0,192 respectivamente. As estruturas tridimensionais desses complexos não apresentam diferenças significativas na estrutura tridimensional na cadeia principal. No entanto, modificações na estrutura tridimensional durante a formação dos complexos, principalmente nas cadeias laterais das enzimas, ocorrem. A estrutura cristalográfica do complexo binário com tripsina mostra que as mais importantes alterações conformacionais ocorrem na região da interface, indicadas pela alteração na acessibilidade dos resíduos de triptofil nessa região de contato. As interações observadas na região da tripsina são as mesmas em complexo binário e ternário. Em contraste, as análises de fluorescência dinâmica mostraram que a interação da quimotripsina com o BTCI não causa alteração na acessibilidade ao solvente dos triptofanos, e a interação da tripsina com o BTCI resulta no enterramento parcial de um grupo triptofil. Neste trabalho, o processo de desdobramento dos complexos binários e ternário do BTCI foi realizado para analisar a estabilidade dessas moléculas. Estes ensaios foram acompanhados por dicroísmo circular utilizando temperatura como agente desnaturante. A associação do BTCI estabilizou a estrutura tridimensional das enzimas, indicado pelos maiores valores da temperatura de transição durante o desdobramento e da energia livre (?G) após formação dos complexos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The inhibitor BTCI (Black-eyed Pea Trypsin and Chymotrypsin Inhibitor) was purified from Vigna unguiculata seeds and crystallized in binary complex with -trypsin and in ternary complex with - chymotrypsin and -trypsin at pH 4.5 and 7.5. The crystallographic data were collected at the National Synchrotron Light Laboratory (LNLS). The crystallographic structures were solved to a maximum resolution of 1.55 Å for the binary complex and 1.70 (pH 7.5) and 1.63 (pH 4.5) for the ternary complexes, by molecular replacement using the structure of the inhibitor from Phaseolus angularis (PDB code 1TAB) as a search model. The final model of the binary complex obtained after several refinement cycles was deposited in the protein data bank (PDB code 2G81). This model is of good quality as indicated by the low values of Rfactor = 0.154 and Rfree = 0.169 and stereochemical parameters within the range of high-resolution structural models. Similarly the ternary complex model showed structural quality at pH 7.5 (Rfactor = 0.171 and Rfree = 0.218) and pH 4.5 (Rfactor = 0.168 and Rfree = 0.192), respectively. The threedimensional structures of these ternary complexes show no significant differences in their main chains. However, conformational changes were observed after complex formation, especially in the side chains of enzymes. The interactions of BTCI with trypsin are the same in binary and ternary complex. Most of the conformational changes of the binary complex with trypsin occur in the interface as indicated by the accessibility of triptofil residues in this contact region. In contrast, fluorescence analysis showed that the interaction of chymotrypsin with BTCI causes no change in solvent accessibility of tryptophans. In this work, the unfolding processes of binary and ternary complexes were performed by circular dichroism using temperature as denaturing agent to analyze the stability of these molecules. The association of BTCI stabilized the three-dimensional structure of the enzymes, indicated by the highest temperature transition and the unfolding free energy (?G) upon formation of complexes.