Impactos do uso da procaína como agente desmetilante de DNA no sitema de cultivo celular de bovinos

Abstract

Após a fecundação natural ou a clonagem por transferência nuclear, um padrão epigenético preexistente deve sofrer uma reprogramação correta para garantir o desenvolvimento embrionário. Contudo, essa reprogramação é ineficiente na clonagem, pois o carioplasto possui um padrão metilação do DNA diferente dos gametas. Acredita-se num aumento da eficiência da clonagem de mamíferos se os carioplastos utilizados possuírem um DNA hipometilado. Este é o primeiro estudo a utilizar a procaína como agente desmetilante no cultivo in vitro em linhagem celular de fibroblastos de bovinos. Os objetivos foram avaliar os efeitos da procaína no cultivo in vitro sobre a viabilidade celular, avaliar a integridade cromossômica e analisar o padrão de metilação no DNA para as regiões diferencialmente metiladas (DMRs) dos genes imprinting IGF2 e XIST, por tratamento com bissulfito de sódio seguido de seqüenciamento, em linhagem celular de Bos taurus indicus. O cultivo celular com a procaína apresentou crescimento celular e a suplementação com 0,1 e 0,5 mM levou a um aumento no número de células viáveis em relação ao grupo controle e ao tratamento com 2,0 mM (P≤0,05). A quantidade de células totais foi menor apenas para o grupo com suplementação de 2,0 mM (P≤0,01). A citogenética não mostrou diferença entre os grupos. O padrão de metilação não foi diferente para as DMRs dos genes avaliados. Existe um efeito benéfico nas células que receberam os tratamentos com 0,1 mM ou 0,5 mM de procaína, por existir um aumento da quantidade de células viáveis sem apresentar anomalias cromossômicas. Há a possibilidade de ter ocorrido uma desmetilação global, que não foi detectada nas regiões analisadas. A suplementação do meio de cultivo com procaína aumentou a viabilidade de fibroblastos in vitro de bovinos, sem alterar a integridade cromossômica. Isso é importante, pois os próximos estudos poderão contribuir, por exemplo, com um aumento dos índices da transferência nuclear de célula somática, maior obtenção de mamíferos transgênicos e possivelmente de células-tronco a partir de células diferenciadas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

After natural fertilization and cloning by nuclear transfer, an epigenetic pattern must be reprogrammed to guarantee viable embryo development. This is the first study to use procaine as a demethylation agent in in vitro culture of of cattle fibroblast cell line. The aim was to investigate the effects of procaine in fibroblast cell line, to evaluate the chromosome integrity and to analyze DNA methylation patterns for DMRs of IGF2 and XIST genes imprinting, by bisulphite tratament followed by sequencing, in Bos taurus indicus. The cell culture with procaine was viable and the supplementation with 0.1 and 0.5 mM led to an increase in the number of cells with intact membrane in comparison to control group and to the treatment with 2.0 mM (P ≤ 0.05). The amount of total cells was lower only for the group supplemented with 2.0 mM (P ≤ 0.01). Cytogenetics showed no difference between groups The methylation pattern was not different for the DMR genes evaluated. We notice a beneficial effect on cells that received treatments with 0.1 mM or 0.5 mM procaine, because there is an increase in number of viable cells which did not present chromosomal abnormalities. It may have occurred a global demethylation, which was not detected in the analyzed regions. Supplementation of medium culture with procaine increased the viability of in vitro culture of bovine fibroblasts, with no alteration in chromosomal integrity. The results obtained here may contribute to increase the levels of cloning and transgenic mammals and possibly stem cells from differentiated cells.