Expressão heteróloga e citolocalização da y-Glutamilcisteína sintetase e Glutationa sintetase de Trypanosoma cruzi

Abstract

O sistema biológico depende de rígido controle do processo de oxidação proveniente do metabolismo. A oxidação pode resultar em danos irreparáveis em inúmeras moléculas importantes para a manutenção da fisiologia celular. Assim, há uma via metabólica voltada para manter esse sistema reduzido, que nos tripanosomatídeos parece ser única, e alguma interrupção causaria danos ao parasito. Nesse intuito, esse trabalho teve como objetivo estudar duas enzimas participantes da via de óxido-redução do Trypanosoma cruzi identificadas como -glutamilcisteína sintetase (GCS) e glutationa sintetase (GS). A sequência nucleotídica dos gene gcs e gs de T. cruzi codificam proteínas de 693 e 535 resíduos de aminoácidos de massa molecular 79,67 kDa e 58,63 kDa respectivamente. Essas proteínas já foram estudadas em muitos organismos, e apresentam sequências altamente conservadas entre os tripanosomatídeos patogênicos. O baixo grau de identidade com a enzima humana é bastante interessante, pois podem representar alvos específicos para o desenvolvimento de quimioterápicos seletivos. As proteínas recombinantes foram expressas em sistema heterólogo de E. coli, a partir do vetor de expressão gcs-pET28a e gs-pET28a. As proteínas foram purificadas sob condições desnaturantes, pois a rGCSTc só está presente na fração insolúvel do lisado bacteriano, e rGSTc da fração solúvel apresentou dificuldades em se ligar na coluna de afinidade. Os anticorpos policlonais produzidos pelos camundongos imunizados foram eficientes no reconhecimento das proteínas recombinantes e das proteínas nativas no extrato total de epimastigotas de T. cruzi. Análise da imunofluorescência revelou que as enzimas são expressas por todas as formas do T. cruzi e localizam-se no interior de vesículas no citoplasma do parasito. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Biological systems depend on the strict control of the oxidation process derived from the metabolism. Oxidation can result in irreparable damage to many molecules important to the maintenance of cellular physiology. Thus, there is a pathway to keep the system reduced, that in trypanosomatids appears to be unique, and any disruption would cause damage to the parasite. At this purpose, this work aimed to study two enzymes participating in the redox pathway of Trypanosoma cruzi, identified as _-glutamylcysteine synthetase (GCS) and glutathione synthetase (GS). The nucleotide sequence of the T. cruzi gcs and gs genes encode proteins of 693 and 535 amino acid residues with molecular masses 79.67 kDa and 58.63 kDa respectively. Their proteins have already been studied in many organisms and their sequences are highly conserved among pathogenic kinetoplastids. The low degree of identity with the human enzyme may represent specific targets for the development of selective chemotherapeutic agents. The recombinant proteins were expressed in E. coli using the expression vectors gcs-pET28a and gs-pET28a. The proteins were purified under denaturing conditions, because the rGCSTc is only present in the insoluble fraction of bacterial lysate and the soluble fraction of rGSTc does not bind to the affinity column under non-denaturating conditions. Polyclonal antibodies against the purified enzymes, raised in mice, were effective in the recognition of the recombinant proteins and their native forms in the total extract of epimastigotes of T.cruzi. Immunofluorescence analysis revealed that the enzymes are expressed in all forms of T. cruzi and located within vesicles in the cytoplasm of the parasite.