Dinâmica da metilação do DNA em embriões de coelho no período pré-implantação

Abstract

A metilação do DNA nos estágios iniciais de desenvolvimento embrionário tem sido considerada importante para a reprogramação diferenciada dos genomas parentais, para a ativação transcricional do genoma embrionário (AGE) e o completo desenvolvimento. No entanto, a dinâmica da metilação do DNA (DM-DNA) parece diferir entre espécies e pode ser alterada pelo ambiente in vitro. Neste sentido, o coelho aparece como um modelo pertinente para a análise dos eventos epigenéticos envolvidos na regulação da AGE, apresentando uma AGE tardia como a maioria dos mamíferos. Além disso, nestes animais, embriões desenvolvidos tanto in vivo como in vitro são de fácil obtenção, o que é de grande interesse. No entanto, a variação da metilação do DNA nunca foi quantificada durante o desenvolvimento pré-implantação de embriões de coelhos desenvolvidos in vivo e a desmetilação do pró-núcleo paterno é ainda controversa nestes animais. Este estudo relatou a dinâmica da reprogramação da metilação do DNA em embriões de coelhos desenvolvidos in vivo (DIV) e cultivados in vitro (CIV) nos estágios de uma célula a blastocisto. Embriões cultivados in vitro foram coletados após a fecundação in vivo e cultivados em meio B2. Os embriões foram imunomarcados com anticorpos anti 5-metilcitosina e o DNA marcado com EthD-2. Em seguida foi realizada a quantificação da imunofluorescência. Os resultados mostraram que a DM-DNA foi diferente entre os pró-núcleos materno e paterno de zigotos DIV. O pró-núcleo materno apresentou um nível constante de metilação durante o estágio de uma célula, resultando em uma metilação de manutenção durante a replicação do DNA. Por outro lado, no pró-núcleo paterno uma desmetilação parcial ocorreu antes da replicação, provavelmente por uma desmetilação ativa do DNA, enquanto uma metilação de manutenção ocorrreu durante a fase S. Além disso, uma desmetilação ocorreu durante as clivagens celulares em embriões DIV e CIV. Mas, a DM-DNA foi diferente entre os grupos de DIV e CIV. Este estudo forneceu a primeira descrição detalhada da DM-DNA em embriões de coelhos e em conjunto, a extensão destes resultados in vivo abre caminho para uma análise das consequências de diferentes condições de cultivo in vitro na metilção do DNA. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

DNA methylation in the early embryo has been considered important for differential parental genome reprogramming, embryonic genome transcriptional activation (EGA) and further development. However, DNA methylation dynamics (DNA-MD) seems to differ among species and may be altered by the in vitro culture environment. The rabbit thus appears to be a pertinent model for analyses of the epigenetic events involved in EGA regulation due to its delayed EGA as in most mammals. Moreover, in these animals, both in vivo and in vitro developed embryos are easy to obtain. However, the variation of DNA methylation was never quantified during the preimplantation development of in vivo-developed rabbit embryos and paternal pronucleus demethylation is still controversial in these animals. This study reported DNA-MD in in vivo-developed (IVD) and in vitro cultured (IVC) rabbit embryos from one cell to the blastocyst stage. IVC embryos were collected after in vivo fertilization and cultured in B2 medium. Immunostaining for 5-methyl cytosine and DNA labeling by EthD2 were performed and the embryos were analyzed by fluorescence quantification. The results showed that DNA-MD differed between the maternal and paternal pronuclei in IVD zygotes. The maternal pronucleus displayed a constant DNA methylation level over the one cell stage, resulting in a maintenance methylation throughout DNA replication. On the other hand, in the paternal pronucleus, partial demethylation occurred before replication, probably by active DNA demethylation, while a maintenance methylation took place over the S-phase. Moreover, a demethylation took place during cell cleavages in IVD and IVC rabbit embryos. Nonetheless, DNA-MD differed between the IVD and IVC groups. This study provided the first detailed description of DNA-MD in rabbit embryos and taken together, the extent of these in vivo results paves the way to the analysis of the consequences of different in vitro culture conditions in DNA methylation.