Isolamento e caracterização parcial da PLA2 frontolipase do veneno da serpente Micrurus frontalis e utilização como fonte de peptídeos opióides

Abstract

Os venenos de serpentes são muito pesquisados pela diversidade de moléculas e suas atividades. Dentre as principais classes de moléculas presentes nesses venenos podem ser destacas PLA2s e neurotoxinas, por possuírem moléculas com ações ocultas, presentes em diferentes sítios das mesmas moléculas. As serpentes da família Elapidae são excelentes representantes desta diversidade, por apresentarem os dois tipos de moléculas. As serpentes brasileiras da família Elapidae estão restritas ao gênero Micrurus, chamadas corais-verdadeiras, pela coloração característica. Micrurus frontalis representa bem esse gênero devido à diversidade de moléculas contidas em seus venenos e alta imunogenicidade, que a levou a ser a principal espécie utilizada na fabricação de soro antielapídico. Este estudo objetivou o isolamento de PLA2s presentes no veneno de Micrurus frontalis, e caracterização de atividades de peptídeos encriptados em suas estruturas primárias. Foram purificadas aproximadamente 30 frações doveneno de M. frontalis por meio de RP-HPLC em coluna semipreparativa, onde as de concentração de fase móvel ACN de eluição maior que 35% em geral apresentavam ao menos uma molecula de massa correspondente à de PLA2s. A fração Mf18 foi escolhida pela pureza e abundancia do componente de massa 13.447,37 Da. Sua estrutura primária foi determinada por Degradação de EDMAN e seqüenciamento de novo após redução, alquilação e digestão com enzima Glu-C. Após comparação com banco de dados de PLA2s presentes em venenos de Elapídeos, a proteína Mf18 foi enquadrada por homologia, na categoria de PLA2s de Classe I, pela presença da alça elapídica característica, número de pontes dissulfeto e comprimento da sequência. Pela conservação da região correspondente à alça ligante ao íon calcio de todas as outras enzimas da Classe I, e pela identidade de seu N-terminal com peptídeos opióides, principalmente encefalina, foram sintetizados 3 peptídeos chamados Elapidorfina-Y, Elapidorfina-W e Elapidorfina-F. Os peptídeos encontrados encriptados na sequência da PLA2 de M. frontalis foram liberados através de síntese em sílica. Após síntese em fase sólida por Fmoc e purificados, as atividades antinociceptivas foram avaliadas pelo ensaio de tailflick e ensaio de formalina. O peptídeo Elapidorfina-Y apresentou significativa atividade antinociceptiva quando comparada ao controle, que se mostrou dependente da dose, do tempo após aplicação e da relação dose X tempo após aplicação. Essa atividade em doses nanoMolares foi comparável aquela obtida com morfina. Nos ensaios de formalina, todos os peptídeos apresentaram atividade antinociceptiva, sendo notadamente maior do que o controle na fase inflamatória para o peptídeo Elapidorfina-W. Muitas proteínas são fontes de peptídeos menores, utilizando para isso diversas formas de serem obtidas, sendo a principal as clivagens de suas sequências mais longas em sítios específicos, dando origem a peptídeos com diversas atividades biológicas, em alvos distintos. Um exemplo dessa possibilidade é o peptídeo Crotalphine que possui atividade antinociceptiva, e a mesma sequência da porção N-terminal da Crotoxina, proteína isolada do mesmoveneno (Crotalus durissus). Os resultados obtidos concordam com o descrito para a própria encefalina, que também é resultado da liberação endógena de um peptídeo por meio de modificações postraducionais da proteína precursora Proencefalina. O presente trabalho mostrou a identificação e caracterização parcial de PLA2 doveneno de Micrurus frontalis e apresentou a atividade antinociceptiva no SNC e periférica de peptídeos liberados de sua sequência por meio de síntese em fase sólida. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Many researches focus on snake venoms due to the diversity of the molecules they possess and their activities. Among the main classes of molecules in these venoms, the PLA2s and neurotoxins are emphasized for pursuing different effects encrypted in each site. The elapidae snakes are excellent representatives of such diversity, because their venoms contain the two kinds of molecules. The brazillian elapidae are restricted to the Micrurus genus also known as the coral-snakes for their characteristic color. Micrurus frontalis well represents this genus for the diversity of molecules and high immunogenicity of its venom that led to its use in the manufacturing of the elapidae antivenom. The objective of this study was to identify, characterize and evaluate the PLA2s present in M. frontalis venom and isolate encrypted peptides with sequences similar to that of bioactive peptides. The initial chromatography step led to the fractionation of the crude M. frontalis venom in approximately 30 fractions by RP-HPLC with C18 semi preparative column. Each fraction that eluted at an ACN mobile phase concentration of 35% and more had at least one molecule with molecular mass corresponding to that of a PLA2. Fraction Mf18 was chosen for its purity and abundance of a component with a mass of 13.447,37 Da, which was then reduced, alkylated had its N-terminal sequenced by EDMAN degradation. The main fraction resulting of refractioning with analytical C18 was digested using a GLU-C V8 enzyme. Each generated enzymatic cleavage fragment was purified and had their primary structure determined by de novo sequencing. After comparisons with online elapidae snake PLA2s databanks, Mf18 protein was placed in the Class I snake PLA2s category due to its similarity, the presence of the elapid loop, the number of disulfide bridges and the sequence length. The high conservation of the region corresponding to the Calcium binding loop among all the Class I snake PLA2s and the identity of this region’s N-terminal to enkephalin’s, led us to use it as a model for the synthesis of three peptides named Elapidorphin-Y, Elapidorphin-W e Elapidorphin-F which only differ in their N-terminal by Y,W and F. Tertiary structure alignment of PLA2s from elapid snakes venoms and mammal pancreas also revealed similarity in the three dimensional structure of this region. After the synthesis, they were purified and had their sequence confirmed my mass spectrometry fragmentation and sequencing. Since the primary and tertiary structures resembles that of the antinociceptive peptide enkephalin, antinociceptive activity was evaluated through the tailflick and the formalin assay. The Elapidorphin-Y peptide presented significant antinociceptive activity when compared to control, dependent on the dose, time after infusion and the relation dose X time. This activity in nanoMolar scale was comparable to that of morphine. In the formalin assays, all the peptides presented antinociceptive activity, and was statistically higher than control in the inflammatory phase for the peptide Elapidorphin-W. The encrypted peptides discovered in a M. frontalis PLA2 sequence were released by solid phase synthesis. Many proteins are sources of smaller peptides, using many different mechanisms to be obtained, among which the main is the cleavage of their sequence at specific sites by endoproteinases originating peptides with diverse activities in various localities. The peptide Crotalphine possesses antinociceptive activity, and in a interesting way presents the same sequence as the Nterminal portion of Crotoxin, a longer PLA2 isolated from the venom of Crotalus durissus, raising the possibility of multiple cleavages after the endogenous synthesis. The obtained results agrees with the described for enkephalin itself, which is also the result of the cleavage from its precursor protein Proenkephalin by different enzymes. In conclusion, the present work showed for the first time the partial sequence of a PLA2 from the venom of M. frontalis and the peripheral and central nervous system antinociceptive activity of peptides released from its sequence by solid phase synthesis.