Perfil proteômico de leveduras de Paracoccidioides após estresse oxidativo

Abstract

O fungo dimórfico Paracoccidioides é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma doença adquirida pela inalação de conídios ou fragmentos de micélio que transitam para a fase patogênica, leveduriforme, nos pulmões do hospedeiro. Após a infecção, a sobrevivência do fungo depende da evasão do sistema imune e adaptação ao ambiente hostil do hospedeiro. Macrófagos alveolares são a primeira linha de defesa contra Paracoccidioides e para conter a infecção essas células produzem várias substâncias nocivas como o peróxido de hidrogênio (H2O2) que desencadeia o estresse oxidativo. Para investigar os efeitos que H2O2 causa no proteoma de Paracoccidiodes, foi utilizada a técnica de eletroforese em gel bidimensional (2-DE) para analisar as proteínas diferencialmente expressas durante a resposta inicial (2 h) e tardia (6 h) ao H2O2. A análise 2-DE revelou um total de 179 proteínas/spots diferencialmente expressos (116 spots com expressão aumentada e 63 com expressão diminuída). As proteínas/spots diferencialmente expressas foram submetidas à identificação por meio da espectrometria de massas e submissão da massa monoisotópica dos peptídeos ao banco de dados do NCBI. Todos os spots/proteínas foram identificados com sucesso e agrupados de acordo com a categoria funcional - FunCat2. Resgate, defesa e virulência celular, metabolismo e energia foram as categorias com as maiores freqüências de proteínas/isoformas. Várias enzimas antioxidantes, como catalase, superóxido dismutase, peroxidases e tioredoxinas foram identificadas, bem como outras oxidoredutases que estão provavelmente envolvidas na resposta contra o estresse oxidativo. O perfil metabólico foi caracterizado, verificando-se ativação da via das pentoses fosfato, uma importante fonte geradora de NADPH celular. No intuito de confirmar os dados proteômicos, ensaios confirmatórios de atividade enzimática, citometria de fluxo e análises dos níveis transcricionais e de NADPH foram realizados e se mostraram concordantes com os dados obtidos na análise proteômica. Os resultados sugerem que Paracoccidioides possui um amplo repertório antioxidante, composto por diferentes proteínas que atuam de maneira complementar, que foram capazes de detoxificar as EROs e de minimizar os efeitos causados pelo estresse oxidativo. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The dimorphic fungus Paracoccidioides is the etiologic agent of paracoccidioidomycosis, a disease acquired by inhalation of infective airborne conidia or mycelia fragments that transit to the pathogenic yeast phase in the host lungs. Upon infection, fungal survival depends on evasion from the immune system and adaptation to the host environment. Alveolar macrophages are the first defense cells line against Paracoccidioides and aiming to restrict the fungal infection, macrophages produce several harmful substances, such as hydrogen peroxide (H2O2) that triggers oxidative stress. To investigate the effect of H2O2 on the proteome of Paracoccidiodes, we used a large scale 2-DE protein gel electrophoresis approach to analyze differentially expressed proteins that were detected in early (2 h) and in late (6 h) H2O2-treatments. The 2-DE analysis revealed a total 179 spots differentially expressed (116 proteins spots with increased expression and 63 with decreased expression). Differentially expressed proteins were subjected to identification by mass spectrometry and by submi tting the monoisotopic mass of the peptides to the NCBI non reduntand database. All spots were successfully identified and they were grouped according the functional category - FunCat2. Cell rescue, defense and virulence, metabolism and energy were the categories that showed the most number of occurrences of the proteins/isoforms. Several antioxidant enzymes, such as catalase, superoxide dismutase, peroxidases and thioredoxins were identified, as well as others oxidoreductases putatively involved with defense against oxidative stress. A view of the metabolic cell profile depicted an activation of the pentose phosphate pathway, a great source of cellular reducing power in the form of NADPH. Confirmatory assays of enzymatic activity, flow cytometry, transcript levels and NADPH measurements, produced data in agreement with proteomic analysis. The results indicated that Paracoccidioides has several antioxidant systems, including various proteins that complementarlly were able to detoxified ROS and minimized the damage triggered by oxidative stress.