Isolamento e construção de cassetes de inativação de genes codificadores de colagenases de Streptococcus mutans com possível envolvimento na degradação colagenolítica em Cárie Radicular

Abstract

A função das bactérias no estágio de desmineralização do desenvolvimento de cárie é bem conhecida. Porém, sabe-se muito pouco de sua função na fase de degradação da matriz colagenolítica. Tendo em vista o pouco conhecimento sobre os mecanismos moleculares envolvidos nesse processo, o estudo constitui a investigação biomolecular acerca da atividade de proteases em lesões cariosas radiculares. O objetivo foi realizar uma manipulação genética de duas colagenases putativas do Streptococcus mutans UA159, codificadas pelos genes SMU_761 e SMU_759 (família PrtC - pepitidase U32), capazes de degradar colágeno tipo I, possivelmente envolvidas no processo de degradação da matriz colagenolítica em lesões cariosas radiculares. Para isto, colônias de S. mutans UA159 foram cultivadas em ágar BHI, por 18h, a 37oC em microaerofilia. Primers específicos para os genes alvo foram desenhados para isolamento por PCR das regiões codantes de interesse (SMU_761 e SMU_759). Os isolados foram clonados no vetor pGEM®-T (Promega) e analisados por digestão com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI. Uma segunda PCR com primers de sítios BamHI e EcoRI foi necessária para o gene SMU_759. A análise dos amplicons revelou tamanhos esperados dos genes SMU_761 (1287pb) e SMU_759 (927 pb) no gel de eletroforese. Uma segunda clonagem foi realizada em plasmídeo denominado pSC, também digerido com as enzimas da primeira clonagem, derivado do plasmídeo altamente sensível à temperatura pHY304, com intuito de paralisar ou inativar as colagenases estudadas. A clonagem e análises de restrição confirmaram a expressão dos genes alvos. Conclui-se que os genes SMU_759 e SMU_761 são de fácil manipulação. Sugerimos, porém, que pode haver importância no genoma pela dificuldade de transformação no S. mutans. As perspectivas desse estudo consideram a transformação e teste dos mutantes com as colagenases inativadas para avaliar se existe influência na formação de lesões cariosas radiculares. Os resultados são essenciais para futura confirmação da função colagenolítica e cariogenicidade em lesões radiculares.